Howley. Virología ADN_7ed

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CAPÍTULO 2 • Papillomaviridae : los virus y su replicación

una estructura de hoja β antiparalela del extremo C por una región llamada fulcrum , 9 como se muestra en la figura 2-9. Además de la proteína E2 de longitud completa, todos los PV codifican una proteína represora de E2 más corta llamada «E8^E2» (revisado en las refs. 69 y 168). La E8^E2 consiste en unos pocos aminoácidos codificados por el ORF de E8 (se superpone a E1) fusionado con la bisagra y el dominio del extremo C de E2 ( véase la fig. 2-9). Estas proteínas antagonizan tanto las funciones de repli- cación como las de regulación transcripcional al competir por los sitios de unión al ADN y al formar heterodímeros inactivos con la proteína transactivadora de longitud completa. Las proteínas E8^E2 también reclutan complejos correpresores celulares como NCoR y SMRT. 68,207 Las funciones represoras de las E8^E2 son importantes para mantener la replicación del ADN y la transcrip- ción de bajo grado, ya que los virus mutados para eliminar la expre- sión de E8^E2 se replican espontáneamente hasta un alto número de copias y sintetizan grandes cantidades de ADN vírico. 69 Algunos PV, como el BPV1, codifican dos proteínas represoras E2: E2-TR y E8^E2. 69 Las proteínas E2 de longitud completa activan y reprimen la transcripción vírica, esto depende de la posición de los sitios de unión al ADN con respecto a otros elementos promotores y poten- ciadores. En los HPV Alphapillomavirus de alto riesgo, hay cuatro sitios de unión a E2 en la URR que median esta regulación ( véase la fig. 2-4). La unión de la E2 del HPV Alphapillomavirus a los sitios de unión adyacentes al promotor temprano principal da lugar a su regulación por disminución. 259 En particular, esta inhibición requiere factores que interactúan con el dominio de transactivación de la proteína E2 de longitud completa, como la proteína Brd4, 240,293 así como la desmetilasa de histonas SMCX y los componentes del complejo TIP60, incluyendo EP400. 240 La interacción de E2 con Brd4 también es necesaria para la función de activación transcripcional de todas las proteínas E2 del PV. 120 La Brd4 es parte de la familia BET, proteínas que contienen dos bromodominios y un dominio extra (ET, extra-terminal ); los bromodominios se unen a citolisinas acetiladas en las histonas y regulan la iniciación y elongación transcripcional. 63 Dos residuos de aminoácidos altamente conservados en el dominio de transactiva- ción de E2 interactúan con Brd4 y son necesarios para la transacti- vación de E2. Además de su papel como regulador transcripcional, E2 des- empeña funciones esenciales en el inicio de la replicación del ADN vírico y en el mantenimiento extracromosómico a largo plazo de los genomas víricos dentro de las células replicadoras, lo que se describe en detalle a continuación. Las múltiples funciones de la E2 están mediadas por interacciones con factores celulares específicos, los más estudiados de los cuales se resumen en la tabla 2-1. El promotor tardío (situado en el ORF de E7 en los HPV Alphapapillomavirus de alto riesgo) se activa en las células de dife- renciación temprana para generar transcritos que expresan grandes cantidades de E1^E4 y de las proteínas de replicación E1 y E2. El promotor tardío está regulado por activadores y represores celula- res que se modulan durante la diferenciación de los queratinoci- tos. 39,291 Los factores de elongación transcripcional, como Brd4, proporcionan una mayor regulación del promotor tardío. 243 El minicromosoma vírico contiene un bucle de cromatina, mediado por CTCF y YY1, que suprime la actividad del potenciador vírico. 197 La regulación por disminución de YY1 dependiente de la diferenciación interrumpe este bucle y remedia la supresión del potenciador. 197 La activación de la transcripción vírica tardía se produce en los queratinocitos diferenciados terminalmente para expresar el ARNm que codifica las proteínas de la cápside. 126 De hecho, la regulación de la lectura del sitio de poliadenilación temprana constituye el

principal cambio de la expresión génica temprana a la tardía. 126 Los verdaderos ARNm tardíos se inician en P L y terminan en el sitio de poliadenilación tardía: A L . Los ARNm tardíos del HPV contie- nen elementos reguladores negativos que reducen la estabilidad del ARNm e inhiben el procesamiento del ARN en las células indiferen- ciadas (revisado en la ref. 99). La diferenciación de los queratinoci- tos reduce las concentraciones de proteínas represoras que se unen a estos elementos. Ensamblaje y liberación del virión El ensamblaje de los viriones tiene lugar en los núcleos de los que- ratinocitos terminalmente diferenciados tras la amplificación del genoma vírico vegetativo y la expresión de las proteínas de la cáp- side. 64 In vitro , la proteína L1 puede autoensamblarse en las VLP, pero la L2 mejora el empaquetamiento del ADN vírico. 136,300 El genoma vírico no requiere una señal de empaquetamiento espe- cífica de la secuencia 34 y se ensambla con las histonas de la célula hospedera en un minicromosoma cromatinizado. 81 Las cápsides se estabilizan aún más por la formación de enlaces disulfuro entre cis- teínas conservadas en monómeros de L1 adyacentes, inducidos por el entorno oxidante en las capas superiores de un epitelio escamoso diferenciado. 50 Los PV no son citolíticos y los viriones se liberan en escamas que se desprenden de la superficie del epitelio. El colapso de los filamentos de citoqueratina, mediado por E4 en estas células dife- renciadas terminalmente, podría ayudar a la liberación del virión. 65 Replicación del ADN vírico El ciclo de vida del PV, dependiente de la diferenciación, requiere diferentes modos de replicación del ADN vírico en diferentes eta- pas (revisado en la ref. 169). Tras la infección de un queratinocito basal, se produce una amplificación limitada del genoma vírico, que luego se establece como un plásmido estable con poca capacidad de copiado. Los genomas víricos se mantienen en un número de copias constante en las células en división y se replican cerca de una vez por ciclo celular durante la fase S, en sincronía con la repli- cación del ADN de la célula hospedera. 96 Esto asegura una infec- ción persistente en las células basales de la epidermis. La replicación vegetativa del ADN se produce en las células más diferenciadas del epitelio infectado. Estas células diferenciadas han salido del ciclo celular y ya no son capaces de soportar la síntesis de ADN celular. Por lo tanto, el virus activa la respuesta al daño del ADN y utiliza la maquinaria de reparación del ADN para apoyar la síntesis del ADN vírico vegetativo produciendo los genomas que se empaquetarán en viriones progenie. 179 Origen de la replicación del ADN La replicación del ADN del papilomavirus requiere un origen de replicación del ADN en cis y las proteínas víricas E1 y E2 en trans . El origen mínimo de replicación del ADN contiene una región rica en A/T, un sitio de unión de E1 y un sitio de unión de E2. 269 La E1 es una helicasa dependiente de trifosfato de adenosina (ATP, adenosine triphosphate ) que se une y desenrolla el ADN en el origen de replica- ción. 80 E2 es un cargador de la helicasa que se une a E1 y facilita la unión de un complejo E1-E2 al origen de replicación. 247

Proteína E1 La proteína E1 está bien conservada entre los PV y es una helicasa dependiente de ATP que se une al origen. La E1 contiene cuatro dominios: un dominio regulador en el extremo N, un dominio de unión al ADN del origen, un dominio de oligomerización y un dominio de helicasa/ATPasa, así como una cola en el extremo C. 17,80 La E1 se une a su sitio conocido en el origen con una afinidad débil; sin embargo, esta unión se ve reforzada a través de su interacción SAMPLE