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CAPÍTULO 15 • Vacunación contra las enfermedades víricas

cir Ab protectores en animales de experimentación. La inmuniza ción mediante la inserción de genes está surgiendo como una forma importante de imitar ciertos aspectos de la infección por virus vivos y puede lograrse mediante una lista cada vez mayor de métodos de aplicación. Inmunización con proteínas o péptidos La inmunización con Ag víricos seleccionados en lugar de utilizar partículas víricas completas tiene varias ventajas teóricas. La produc ción de proteínas víricas recombinantes o péptidos sintéticos reduce el riesgo de contaminación por patógenos no reconocidos. Además, la preparación de vacunas libres de ácido nucleico elimina las preo cupaciones teóricas sobre la recombinación o integración del ácido nucleico vírico. La inmunización con Ag individuales o epítopos del virus también podría reducir la competencia antigénica y enfocar la respuesta en los sitios antigénicos protectores más relevantes. Antes de poder utilizar la expresión de proteínas víricas en células eucariotas como método de producción de vacunas, es preciso supe rar varios obstáculos. En primer lugar, es esencial identificar el inmu nógeno correcto. En segundo lugar, es necesario producir proteínas de forma muy eficiente para que este abordaje sea económicamente viable. Los mecanismos para potenciar la expresión de proteínas víri cas que se han estudiado se centran principalmente en la identifica ción de promotores potentes de la expresión génica y el desarrollo de técnicas para una amplificación génica eficaz. En tercer lugar, las pro teínas víricas deben separarse eficazmente de las proteínas de la célula hospedera, del ADN y de los agentes contaminantes endógenos. Por último, las proteínas deben producirse con la estructura y la activi dad deseadas. Este último requisito es especialmente preocupante, ya que las líneas celulares inmortalizadas de mamíferos son idea les para producir proteínas víricas porque es más probable que las modificaciones postraduccionales sean auténticas que cuando estas proteínas se producen a partir de hospederos procariotas. El ADN de la célula hospedera debe reducirse de manera considerable en la vacuna final (la directriz de la FDA es de menos de 10 ng por dosis) para reducir el potencial teórico de acontecimientos oncogénicos. Además, debe procederse a la eliminación e inactivación de los virus endógenos en el caso de los productos elaborados a partir de líneas celulares continuas de roedores y otros mamíferos. Se han desarro llado técnicas de ADN recombinante para promover la secreción de glucoproteínas víricas en el medio, con el fin de facilitar la separación eficaz de las proteínas víricas de las proteínas de la célula hospedera. En cuarto lugar, los procedimientos utilizados para producir y puri ficar las proteínas víricas deben ser lo suficientemente suaves como para mantener la proteína en su estado natural, conservando así los epítopos de neutralización dependientes de la conformación necesa rios para inducir Ab protectores. Por último, dado que las proteínas monoméricas purificadas suelen ser inmunógenos débiles, es nece sario formularlas con adyuvantes o producirlas como oligómeros o partículas para potenciar su inmunogenicidad. El siguiente análisis de estos abordajes no pretende ser exhaustivo en su alcance, sino ilus trativo de las estrategias actuales en uso o en desarrollo. Las técnicas de ADN recombinante se utilizan habitualmente para expresar proteínas víricas en células de levaduras, insectos o mamíferos. La utilidad de la expresión en levaduras para producir la vacuna contra la hepatitis B ya se ha descrito, y las levaduras también se emplean para producir VLP del HPV. 271 Algunas proteínas víricas, como la glucoproteína G del virus de la rabia, son más difíciles de producir en levaduras. 408 Un gran avance en la producción de Ag víricos ha sido el desa rrollo de vectores de baculovirus para expresar genes exógenos a monoméricas purificadas suelen ser inmunógenos débiles, es nece par partículas para potenciar su inmunogenicidad. E tículas para potenciar su inmunogenicidad. E de estos abordajes no pretende ser exhaustivo en su alcance, sino ilus © epítopos de neutralización dependientes de la conformación necesa 2024 En cuarto lugar, los procedimientos utilizados para producir y puri para mantener la pr para mantener la proteína en su estado natural, conser oteína en su estado natural, conser Wolters celulares continuas de roedores y otros mamíferos. Se han desarro oteínas víricas en el medio, con el fin de facilitar la separación Kluwer, Inc. oteínas se producen a partir de hospederos procariotas. El ADN último, las proteínas deben producirse con la estructura y la activi talizadas de mamíferos son idea Producción de proteínas víricas en células eucariotas

altos valores en células de insectos bajo el control de un promo tor fuerte de baculovirus, como el promotor de la polihedrina. 274 Con este sistema, se pueden producir proteínas en grandes cantida des (1 mg/10 6 células). Asimismo, pueden producirse glucoproteínas víricas. Por ejemplo, las HA del virus de la influenza producidas por baculovirus se pueden producir de manera eficiente y tienen una inmunogenicidad equivalente o superior al producto tradicional trivalente dividido en adultos. 30 Las vacunas proteínicas basadas en las HA del virus de la influenza producidas en cultivos celulares de insectos están aprobadas en los Estados Unidos desde el 2013 (Flu blok ® o Flublok ® tetravalente). El sistema de baculovirus también puede emplearse para expresar inmunógenos víricos más complica dos que requieren el procesamiento de poliproteínas para generar proteínas de superficie inmunógenas naturales. Un ejemplo de ello es la expresión de toda la región de la proteína estructural (C-E3-E2 6K-E1) de un alfavirus para generar auténticas proteínas víricas pro cesadas capaces de inducir una respuesta de Ab neutralizantes eficaz en animales de experimentación .209 También se han usado células de mamíferos para producir pro teínas víricas que puedan incorporarse a una vacuna de subunidades. Los cultivos de células de mamífero representan un sistema óptimo para producir proteínas víricas porque el plegamiento, el transporte y el procesamiento de proteínas se aproximan mucho a los que se pro ducen en el hospedero infectado. Los abordajes iniciales consistían en purificar las proteínas víricas a partir de células infectadas o de células transducidas con un sistema de expresión de virus recombinante dise ñado para un alto grado de expresión del Ag vírico 153,154 o mediante transfección transitoria con ADN. Se han desarrollado líneas celula res que pueden producir de forma estable proteínas recombinantes o Ab, pueden modificarse para la producción a gran escala y han logrado la aprobación reglamentaria para productos clínicos. Las células de ovario de hámster chino han sido durante mucho tiempo una línea celular preferida para producir terapias basadas en proteínas. 459 Estas células se han utilizado para producir gluco proteínas víricas del HIV y el HSV que han avanzado hasta ensayos de eficacia 147,388,438 y pueden modificarse para mejorar aún más la eficiencia y la capacidad de fabricación. Las líneas celulares huma nas inmortalizadas derivadas de material embrionario humano sano también han surgido como líneas celulares para la producción de proteínas, como la 293 y la PER.C6. Ambas líneas se han utilizado ampliamente para producir vectores de inserción de genes, tienen un historial de pases plenamente documentado y hasta la fecha no se han identificado agentes contaminantes ni potencial oncógeno o teratógeno. La línea PER.C6 se derivó de células embrionarias de la retina y se inmortalizó con el gen de la E1 de adenovirus. La 293 ORF6 tiene una historia de desarrollo similar y contiene el marco de lectura abierto 6 del gen de la E4 de adenovirus, así como el gen de la E1. 59 Estas líneas celulares completamente humanas pueden propor cionar ventajas para producir glucoproteínas de virus que repliquen auténticamente las estructuras presentes en la infección humana, pueden adaptarse a diferentes condiciones de crecimiento y pueden producir de forma estable altos valores de proteína recombinante sin amplificación génica. 223 En general, la identificación de plataformas de líneas celulares humanas inmortalizadas para producir proteínas, VLP, virus completos o vectores de vacunas será preferible al uso de líneas celulares primarias que tienen que ser revalidadas repeti damente o al uso de métodos de producción menos eficientes que requieren infección transitoria o transfección. Producción de proteínas víricas en células procariotas La producción de proteínas víricas inmunógenas en células procario tas es difícil y requiere una amplia reingeniería del gen para conseguir estructuras inmunógenas debido a las diferencias en el procesamiento de las proteínas y en el microambiente. Sin embargo, ha habido o A o Ab , pueden modificarse para la producción a gran escala y han reproduction el procesamiento de proteínas se aproximan mucho a los que se pro purificar las pr oteínas víricas a par transducidas con un sistema de expresión de virus recombinante dise transfección transitoria con ADN. Se han desarrollado líneas celula of os de células de mamífer the También se han usado células de mamíferos para producir pro content 6K-E1) de un alfavirus para generar auténticas proteínas víricas pro is ficie inmunógenas naturales. Un ejemplo de ello prohibited. insectos están aprobadas en los Estados Unidos desde el 2013 (Flu puede emplearse para expresar inmunógenos víricos más complica

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