9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

eliminó la actividad de metiltransferasa de la nsp16 del SARS-CoV; del mismo modo, la mutación de los aminoácidos que recubren el bolsillo de unión a la SAM comprometió gravemente la actividad. 71 Se identificó un surco putativo hidrófobo de unión al ARN que con duce al sitio catalítico utilizando la metiltransferasa VP39 del virus vaccinia unida a ARN como plantilla. La función de la metilación 2 ′ - O en los mRNA de mamíferos y virus fue incierta durante muchos años, ya que no es necesaria para la traducción del mRNA. 65 El papel de esta modificación del ARN para distinguir los mRNA hospederos de los no hospederos se describió por primera vez en el virus del Nilo Occidental, un flavivirus; el virus vaccinia, un poxvirus; y el coronavirus MHV, donde la inactivación mutacional de las actividades de 2 ′ - O –MTasa de estos virus los hizo más sensibles al IFN y a las proteínas IFIT estimuladas por el IFN. 65 Esto implicó a las nsp16 de los coronavirus en la evasión inmunitaria. La inactivación mutacional de la nsp16 en el MHV o el HCoV-229E dio lugar a una mayor producción de IFN en macrófagos infectados acompañada de una menor replicación vírica en comparación con los virus recombinantes con un gen nsp16 de tipo silvestre. 445 La induc ción de IFN tras la infección por un MHV mutante recombinante deficiente en 2 ′ -O –MTasa dependió de que el macrófago tuviera una proteína MDA5 funcional. El papel de la nsp16 en la evasión inmunitaria in vivo se constató gracias al fracaso de un mutante de la 2 ′ - O –MTasa recombinante del MHV-A59 para infectar produc tivamente el hígado y el bazo de ratones expuestos por inoculación intraperitoneal. 445 Estas observaciones se extendieron al SARS-CoV utilizando el modelo del SARS-CoV adaptado al ratón MA15, en el que la inactivación mutacional de la actividad de 2 ′ -O –MTasa de la nsp16 del SARS-CoV dio lugar a una infección atenuada tanto in vitro como in vivo y los virus atenuados fueron más sensibles al IFN. 245 Al igual que en el caso del MHV, la atenuación de los mutantes de la nsp16 dependía de las proteínas MDA5 e IFIT intactas. También se analizó la capacidad de los mutantes atenuados de la nsp16 nega tivos a la 2 ′ -O –MTasa para servir como plataforma de vacunas vivas atenuadas. La inmunización de ratones con el SARS-CoV adaptado a ratones con una nsp16 enzimáticamente inactiva produjo inmuni dad protectora frente a la exposición con el MA15 de tipo silvestre. Se obtuvieron resultados similares con el MERS-CoV portador de una mutación de la 2 ′ -O–MTasa en la nsp16, 247 lo que sugiere que este abordaje para el desarrollo de vacunas vivas atenuadas podría ser aplicable a una amplia gama de coronavirus. Dado que la actividad enzimática de la nsp16 depende de su activación alostérica mediante la unión a la nsp10, los péptidos cortos o los compuestos peptido miméticos dirigidos a la interfase de interacción de estas dos proteí nas constituyen un abordaje potencial para un tratamiento antiviral. Este abordaje se probó experimentalmente mediante el desarrollo de un péptido corto dirigido a la interacción nsp10-nsp16 y mostró que inhibía la actividad de 2 ′ - O –MTasa de varios coronavirus in vitro e inhibía la replicación del MHV en cultivos celulares y atenuaba la infección y la patogénesis in vivo. 390 Con el inicio de la pandemia de COVID-19, cuatro grupos deter minaron la estructura de los complejos nsp10-nsp16 del SARS-CoV-2 mediante radiocristalografía. 253,307,378,399 Las estructuras eran similares a las determinadas para la nsp16 del SARS-CoV. También se determi naron las estructuras en presencia y ausencia de un análogo del capu chón, 7me GpppA, la SAM, la SAH o el análogo de SAH sinefungina, lo que permitió identificar los bolsillos de unión a la estructura Cap-0 y a la SAM. 253,307,378,399 La nsp16 experimenta un cambio conformacional al unirse a la SAM y a su sustrato de ARN, acercando los residuos cata líticos de la nsp16 a sus sustratos. 378 La presencia de cationes divalentes estabiliza las interacciones entre la nsp16 y su sustrato de ARN, mejo rando la alineación del ARN en el sitio activo. 253 Una comparación de la estructura de la nsp16 del SARS-CoV-2 con las metiltransferasas

de mamíferos reveló una inserción de cuatro aminoácidos que es exclu siva de los coronavirus y promueve la actividad catalítica de la nsp16 alterando la conformación de la estructura del ARN en su surco de unión. 253 Esta inserción de cuatro residuos se sugirió como un objetivo prometedor para el diseño de inhibidores específicos de coronavirus de la actividad de 2 ′ - O –MTasa de la nsp16. Además del papel bien des crito de la actividad de 2 ′ - O –MTasa de la nsp16 en la evasión inmu nitaria antes descrita, se ha informado que la nsp16 sobreexpresada se une a los ARN nucleares pequeños (snRNA, small nuclear RNA ) U1/U2 e inhibe así el empalme. 16 El hecho de que la nsp16 puede identificarse en el núcleo de las células infectadas por el SARS-CoV-2 mediante tinción inmunofluorescente apoya la idea de que la nsp16 puede suprimir la respuesta al IFN interfiriendo en el empalme ade cuado de los transcritos de IFN y de los que responden al IFN. La identificación de la base estructural de la unión a los snRNA U1/U2 seguida de experimentos de genética inversa es necesaria para propor cionar la confirmación del efecto de la nsp16 en el empalme durante la infección por el SARS-CoV-2. Las proteínas accesorias de los coronavirus difieren entre los linajes de virus humanos. Las proteínas codificadas por estos genes suelen anta gonizar las respuestas inmunitarias innatas de las células del hospedero. Al igual que otros virus de ARN, los coronavirus producen dsRNA al principio del ciclo de infección como un intermediario en la replicación del genoma y la transcripción del mRNA. 346 Los receptores de reconocimiento de patrones (PRR, pattern recognition receptors ) de las células hospederas detectan el dsRNA vírico como patógeno no propio y responden activando diversas vías antivíricas crí ticas para la defensa temprana contra la invasión vírica. La detección del dsRNA por los PRR citosólicos conduce a la activación de tres vías clave: la producción y señalización de IFN, la OAS-RNasa L y la PKR. 149 La detección del dsRNA por la MDA5 durante la infección por coronavirus 309 conduce a la señalización a través de la proteína de señalización antivírica mitocondrial (MAVS, mitochondrial antivi ral signaling ) que conduce a la activación y la translocación nuclear del factor de transcripción IRF3 y a la producción de IFN de tipo I ( α / β ) y de tipo III ( λ ). Al unirse a su receptor específico de la super ficie celular, el IFN promueve la fosforilación por la cinasa Jano y la translocación al núcleo de los STAT1 y STAT2, que inducen la expre sión de ISG con actividades antivíricas. 226,294 Paralelamente, el dsRNA también es detectado por las OAS, principalmente la OAS3, que sin tetiza oligoadenilatos ligados a 2 ′ ,5 ′ (2-5A), 211,397 los cuales inducen la dimerización y la activación de la RNasa L, lo que lleva a la degrada ción del ARN pequeño monocatenario vírico y del hospedero y a la inhibición de la síntesis proteínica. 80 Por último, también en paralelo, la detección del dsRNA por la PKR induce la autofosforilación de esta enzima, lo que permite que fosforile el factor 2 α de iniciación de la traducción eucariota y provoque la inhibición de la síntesis pro teínica. 313 Mientras que las actividades antivíricas de la RNasa L y la PKR no dependen de la producción de IFN, 397 las OAS y la PKR son codificadas por ISG; por lo tanto, estas vías pueden ser activadas o reguladas aún más por los IFN. Del mismo modo, la activación de la RNasa L y la PKR puede promover el estrés celular, la inflamación o la muerte apoptótica. 16,43,45,169,234,438 Por lo tanto, estas vías antivíricas también son destructivas para la célula, lo que reduce todavía más la viabilidad de la célula hospedera. Los coronavirus utilizan gran parte de sus genomas para codi ficar proteínas que antagonizan las defensas del hospedero mediante PROTEÍNAS ACCESORIAS DEL SARS-COV-2

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