9788419284617_Howley.Virus de ARN

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CAPÍTULO 21 • Coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2

retroceso de la RdRp podría permitir la extrusión del extremo 3 ′ de un ARN de cadena cebador mal emparejado en el retroceso, donde sería accesible al ExoN unido a la molécula de la nsp12 opuesta. Los datos de crio-ME no descartan la posibilidad de que la corrección del ARN sea llevada a cabo por un heterodímero nsp10-nsp14 que actúe sobre un complejo monomérico de replicación-transcripción compuesto por las nsp7-nsp8 2 -nsp9-nsp12-nsp13 2 o las nsp8 2 -nsp9 nsp12-nsp13 2 -nsp10-nsp14. Los datos que mostraban que la acti vidad del ExoN era necesaria para la viabilidad del SARS-CoV-2 y que otros coronavirus que eran capaces de tolerar la inactivación mutacional del ExoN eran más sensibles a antivirales como el rem desivir han llevado a la búsqueda computacional y bioquímica de inhibidores de la actividad del dominio ExoN. Un análisis ha iden tificado dos compuestos, la patulina y el ácido aurintricarboxílico, que inhiben la actividad del dominio ExoN del complejo nsp10 nsp14 del SARS-CoV-2 de forma dependiente de la concentración e inhiben la replicación de este virus a bajas concentraciones micro molares 37 y sinergizan con el remdesivir en la inhibición de la repli cación del virus. Chen y cols. 50 identificaron por primera vez que la nsp14 del SARS-CoV tenía una actividad de guanina- N 7–MTasa mediante un análisis genético funcional en levaduras en busca de enzimas nece sarias para la formación del capuchón en 5 ′ . La N 7–MTasa cataliza la reacción que constituye el tercer paso en la formación del capu chón. Los análisis bioquímicos con la nsp14 purificada confirmaron que la proteína transfería un grupo metilo de la S -adenosilmetionina (SAM) a la posición N7 de la guanina de un sustrato GpppRNA para sintetizar una estructura Cap-0. Además, asignaron la activi dad al CTD de la nsp14 mediante mutagénesis. La alineación con otras N 7–MTasas y un análisis de la estructura secundaria prevista permitieron identificar un motivo DxG conservado que forma parte del sitio de unión a la SAM en otras metiltransferasas. Las muta ciones en este sitio suprimieron la actividad de N 7–MTasa de la nsp14 en el análisis de transcomplementación en levadura sin afec tar su actividad del dominio ExoN. Del mismo modo, las muta ciones en el sitio catalítico del ExoN de la nsp14 no inactivaron la actividad de N 7–MTasa. Otros experimentos con un replicón del SARS-CoV mostraron que la replicación del ARN y la transcrip ción estaban considerablemente alteradas en replicones portadores de mutaciones inactivadoras en el motivo DxG, lo que muestra la importancia de la actividad de N 7–MTasa en la replicación vírica. La caracterización bioquímica de la nsp14 purificada y expresada bacte rialmente confirmó los resultados previos del análisis de complemen tación en levadura y mostró la necesidad de la SAM como donante de metilo. 28 La unión de la nsp10 a la nsp14 no consiguió aumentar la actividad de N 7–MTasa. 28 La estructura cristalina del heterodí mero nsp14-nsp10 230 mostró que el dominio N 7–MTasa contenía un pliegue de metiltransferasa atípico. Contiene una lámina β con cinco hebras β en lugar de las siete habituales, las cuatro primeras orienta das en paralelo y la última en sentido antiparalelo. Además, hay una pequeña lámina β antiparalela de tres hebras que se inserta perpen dicularmente a la lámina β central entre las dos últimas hebras de la lámina central, que junto con una hélice α aminoterminal forma un bolsillo que aloja firmemente a GpppA con la guanina N7 proximal al grupo metilo de la SAM en una posición para efectuar la reacción de transferencia de metilo. La mutación de los residuos que compo nen el bolsillo de unión a GpppA confirmó su papel en el posicio namiento de la guanina en la posición y orientación adecuadas para aceptar el grupo metilo. También hay un dedo de zinc situado desti lado al sitio activo de la N 7–MTasa. Los estudios estructurales del complejo ampliado de replica ción del SARS-CoV-2 (nsp7-nsp8 2 -nsp9-nsp12-nsp13 2 ) han per mitido comprender mejor cómo se generan los extremos 5 ′ de los mRNA de los coronavirus. 413 En este complejo, el sitio catalítico del

dominio NiRAN de la nsp12 responsable de la reacción de trans ferencia de guanililo al extremo 5 ′ desfosforilado del ARN en alar gamiento se encuentra frente al sitio catalítico de la N 7–MTasa de la nsp14. El dedo de zinc de función desconocida de la N 7–MTasa está situado en una vía de transferencia potencial del GpppRNA al sitio activo de la N 7–MTasa y se cree que desempeña un papel en esta transferencia. El brote de la pandemia de COVID-19 desenca denó la búsqueda de inhibidores de la N 7–MTasa del SARS-CoV-2. Dos análisis bioquímicos de quimiotecas utilizando la nsp14 puri ficada identificaron una serie de inhibidores de la N 7–MTasa. 20,173 Los inhibidores más potentes sin toxicidad inhibieron la replicación vírica a bajas concentraciones micromolares. Un estudio sobre la función de las nsp1-nsp16 del SARS-CoV-2 como inhibidoras de la síntesis proteínica y de la respuesta al IFN identificó la sobreex presión ectópica de la nsp14 como posible inhibidor de estos proce sos. 142 La inactivación mutacional de las actividades de endonucleasa del ExoN de la nsp14 del SARS-CoV-2 o de la N 7–MTasa anuló la capacidad de la nsp14 para inhibir la traducción, y la inhibición de la traducción aumentó con la coexpresión de la nsp10, lo que sugiere que las actividades enzimáticas de la nsp14 son importantes en este efecto. Aún no se ha constatado que la nsp14 ejerza un efecto inhi bidor en la traducción durante la infección vírica ni se conoce su mecanismo. Nsp16 La nsp16 es una proteína de 298 aminoácidos que es liberada del polipéptido precursor pp1ab por el dominio Mpro de la nsp5. 74,345 Las secuencias de las proteínas del SARS-CoV y el SARS-CoV-2 son idénticas en un 93.3%. Se predijo que la nsp16 tenía una actividad de 2 ′- O –MTasa con base en el análisis comparativo de secuencias. 345,381 Contiene los cuatro aminoácidos catalíticos conservados, K-D-K-E, y un sitio de unión a la SAM conservado que es característico de esta familia de enzimas. Los análisis bioquímicos de la nsp16 expresada bacterialmente y purificada del coronavirus felino mostraron que era capaz de unirse a una estructura Cap-0 ( 7me GpppRNA) que contenía un sustrato de ARN corto y transferir un grupo metilo de la SAM a la posición 2 ′ - O del primer nucleótido transcrito, el último paso en la síntesis de un capuchón en 5 ′ completamente funcional (Cap-1). La enzima requería la presencia del grupo guanina- N 7-metilo para que la nsp16 se uniera al sustrato de ARN, lo que la situaba secuen cia abajo de la reacción de N 7–MTasa catalizada por la nsp14 en la síntesis del capuchón en 5 ′ . 70 El análisis mutacional confirmó que los residuos K-D-K-E eran esenciales para la actividad enzi mática. Aunque la nsp16 del coronavirus felino es capaz de llevar a cabo esta reacción en ausencia de otras proteínas víricas, la activi dad de 2 ′- O –MTasa de la nsp16 del SARS-CoV depende absoluta mente de la unión de la nsp10. 28,228 La unión de la nsp10 a la nsp16 permitió que la nsp16 del SARS-CoV se uniera a sus dos sustratos, 7me GpppRNA y SAM. 51 La estructura de la nsp16 del SARS-CoV en complejo con la nsp10 se determinó mediante radiocristalografía y contiene un pliegue canónico de metiltransferasa de lámina β de siete hebras. 51,71 Las mutaciones de la interfase de unión nsp10-nsp16 del SARS-CoV que suprimen su interacción también suprimen la acti vidad de 2 ′ -O –MTasa de la nsp16. 51,71,228 La S -adenosilhomocisteína (SAH), un producto de la reacción de metiltransferasa después de que el grupo metilo se haya transferido de la SAM al ARN, se visualizó e identificó en el bolsillo de unión a la SAM. Los residuos que compo nen el bolsillo de unión a la SAM se conservan entre las nsp16 de los coronavirus. La unión de la SAM en su bolsillo de unión a la nsp16 aumentó la formación de complejos nsp10-nsp16 enzimáticamente activos a través de un efecto alostérico. 14 Por el contrario, la diso ciación de la SAH, un producto de la reacción de metiltransferasa, del bolsillo de unión a la SAM promovió la disociación del com plejo nsp10-nsp16. La mutación de los residuos K-D-K-E a alanina

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