9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

de plantilla como una ampliación monocatenaria en 3 ′ en el sitio activo. Este mismo estudio mostró que el dominio ExoN era capaz de eliminar el remdesivir-MP que se había incorporado al ARN sus trato, lo que concuerda con trabajos anteriores que mostraban que la sensibilidad al remdesivir aumenta en los coronavirus portado res de mutaciones en el sitio catalítico del ExoN. 3 Otro estudio de crio-ME de un complejo con la estequiometría de nsp7-nsp8 2 -nsp9 nsp12-nsp13 2 -nsp10-nsp14 y un ARN de plantilla con un empare jamiento de bases parcial con una ampliación en 5 ′ no emparejada reveló que el complejo nsp10-nsp14 se unía al complejo ampliado de replicación (nsp7-nsp8 2 -nsp9-nsp12-nsp13 2 ) en un valle poco profundo presente entre la nsp9 y el dominio NiRAN de la nsp12, con ambos dominios en contacto con el dominio ExoN de la nsp14 y la nsp10 en contacto con el dominio NiRAN (fig. 21-11A y B). 413 En las imágenes captadas por crio-ME, una mayor proporción de las moléculas de este complejo eran dímeros antiparalelos lado a lado en lugar de monómeros (fig. 21-11C). En este dímero, el sitio catalítico del dominio ExoN se encuentra en relativa proximi dad al túnel de ingreso de NTP de la RdRp, lo que sugiere que el

nsp10 del SARS-CoV-2 a la nsp14 promueve su actividad del domi nio ExoN. 229 La especificidad de sustrato del dominio ExoN del SARS-CoV-2 es similar a la de la nsp14 del SARS-CoV en el sentido de que elimina nucleótidos mal emparejados en el extremo 3 ′ de un dsRNA, con la excepción de que también es capaz de hidrolizar ARN en el contexto de un híbrido ARN:ADN mal emparejado en 3 ′ . 229 La base estructural del reconocimiento del desajuste se ha investi gado mediante estudios de crio-ME de plantillas sintéticas unidas a heterodímeros nsp10-nsp14 del SARS-CoV-2 (fig. 21-11). 220 La unión de un ARN parcialmente bicatenario con una ampliación monocatenaria en 5 ′ y un par de bases en el extremo 3 ′ mal empa rejado al heterodímero nsp10-nsp14 produjo cambios conformacio nales locales del dominio ExoN, estrechando ligeramente el sitio de unión del ARN y desplazando la posición de los residuos catalíti cos estabilizando una conformación activa de la enzima. La unión del ExoN al ARN sustrato abarca los dos últimos residuos de los nucleótidos con un completo emparejamiento de bases, volteando el nucleótido no emparejado de la cadena de plantilla fuera de la hélice de ARN, dejando el nucleótido mal incorporado de la cadena

FIGURA 21-11 Estructuras de criomicroscopía electrónica de complejos monoméricos y diméricos de replicación-transcripción extendida del SARS-CoV-2 que contienen el heterodímero nsp10-nsp14.A. Diagrama esquemático de la estructura de los dominios de cada componente del complejo. Nsp7, morado intenso ; nsp 8-1, gris ; nsp 8-2, verde cian ; nsp9, azul púrpura ; nsp10, pizarra ; NiRAN de la nsp12, amarillo ; interfase de la nsp12, naranja ; dedos de la nsp12, azul ; palma de la nsp12, rojo ; pulgar de la nsp12, verde bosque ; ZBD de la nsp13, verde claro ; S de la nsp13, salmón ; 1B de la nsp13, violeta ; 1A de la nsp13, arena ; 2A de la nsp13, rosa fuerte ; ExoN de la nsp14, verde pálido ; N 7 – MTasa de la nsp14, marrón . B. Tres vistas perpendiculares de las densidades de criomicroscopía electrónica del complejo monomérico. C. Tres vistas perpendiculares de las densidades de criomicroscopía electrónica del complejo dimérico. Las líneas discontinuas indican el límite entre los dos complejos que forman el dímero (adaptada con autorización de Yan L, Ge J, Zheng L, et al. Cryo-EM structure of an extended SARS-CoV-2 replication and transcription complex reveals an intermediate state in cap synthesis. Cell 2021;184(1):184–193.e10. Copyright © 2020 Elsevier).

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