9788419284617_Howley.Virus de ARN

727

CAPÍTULO 21 • Coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2

los mRNA. 94,351 En este complejo, la nsp12 interactúa con los domi nios ExoN y de N 7–MTasa de la nsp14. Los experimentos de genética inversa con el alfacoronavirus HCoV-229E mostraron que la sustitución de cualquiera de los cuatro residuos DDED conservados en el sitio catalítico de la exonucleasa era letal para la replicación del virus debido a la gran reducción de la síntesis de ARN vírico, lo que sugiere que la actividad de exonu cleasa era un objetivo terapéutico potencial. 254 Las mutaciones en el sitio activo del dominio ExoN del MHV y la nsp14 del SARS-CoV no eran letales, pero daban lugar a virus con una síntesis de ARN vírico deteriorada y déficits de proliferación modestos, 84,85 a la vez que aumentaban considerablemente las tasas de mutaciones, lo que apoyó la idea de que el dominio ExoN tenía un papel funcional en la corrección del ARN. Curiosamente, mutaciones similares en el dominio ExoN de la nsp14 del MERS-CoV deterioraron gravemente la actividad enzimática y redujeron de manera notable la síntesis de ARN vírico y fueron letales para el MERS-CoV, lo que sugiere un posible papel en la replicación más allá de la corrección de errores. 273 Esto se confirmó en un estudio de recombinación en tres betacoro navirus (MHV, MERS-CoV y SARS-CoV-2), el cual mostró que los acontecimientos de recombinación eran amplios durante la síntesis del ARN y que las mutaciones inactivadoras en el dominio ExoN disminuían la frecuencia y alteraban el espectro de los productos de recombinación. 121 Es importante destacar que la actividad de nucleasa del dominio ExoN desempeña un papel clave en la resistencia rela tiva de los coronavirus a algunos análogos de nucleósidos. El MHV recombinante y el SARS-CoV portadores de mutaciones catalítica mente inactivadoras en el dominio ExoN presentaron una dismi nución de la proliferación 300 veces superior en respuesta al 5-FU en comparación con el efecto más modesto del fármaco en los virus de tipo silvestre. 343 La mayor respuesta al 5-FU va acompañada de un aumento de 24 veces en la tasa de mutaciones con respecto a la observada durante las infecciones con virus de tipo silvestre trata dos con una dosis equivalente de 5-FU. La mayoría de las mutacio nes fueron las transiciones de A a G y de U a C que se esperan de la incorporación del 5-FU en los genomas en replicación, seguida de una alteración del 5-monofosfato de fluorouridina incorporado durante las siguientes rondas de síntesis del ARN. Además, las cepas recombinantes del MHV con un ExoN catalíticamente inactivo fue ron más de cinco veces más sensibles al remdesivir que el virus de tipo silvestre. 3 Estas observaciones apoyan la idea de que al menos una función del dominio ExoN de la nsp14 es la corrección del ARN, y puede mediar la resistencia relativa de los coronavirus a los análogos de nucleósidos. 3,343 Además de su función de corrección de errores, las mutaciones que hacen que el dominio ExoN sea catalíticamente inactivo incrementan la sensibilidad del MHV al IFN; la actividad del ExoN de la nsp14 es necesaria para que el MHV se replique en macrófagos y supere la respuesta inmunitaria innata de la célula, 41 lo que sugiere un papel de este dominio en la evasión inmunitaria de los coronavirus. Esto es coherente con la observación de que el SARS-CoV portador de un dominio ExoN catalíticamente inactivo se atenúa en un modelo de ratón envejecido del SARS. 118 Con el inicio de la pandemia de COVID-19, se investigó el papel del dominio ExoN en la replicación del SARS-CoV-2 y su potencial resistencia a los análogos de nucleósidos. Las mutaciones inactivadoras en el sitio catalítico del ExoN fueron letales, de forma similar a este efecto en el MERS-CoV. 273 Esto contrasta con el efecto de mutaciones similares en la enzima del SARS-CoV, donde se pudo recuperar el virus infeccioso en experimentos de genética inversa, 84,85 y es sorprendente teniendo en cuenta la similitud mucho mayor del dominio ExoN del SARS-CoV-2 con la enzima del SARS-CoV (99.7% de identidad) que con la secuencia del MERS-CoV (63% de identidad). Al igual que ocurre con otros coronavirus, la unión de la

Nsp14 Las proteínas nsp14 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 miden 527 aminoácidos de longitud y son escindidas proteolíticamente de su precursor pp1ab por el dominio Mpro de la nsp5. 345 La nsp14 contiene dos dominios, cada uno con una actividad enzimática diferente: una actividad de exonucleasa aminoterminal, designada como ExoN , 254,345 y una actividad de N 7–MTasa. 50 Se predijo que el dominio ExoN era una exonucleasa de 3 ′ a 5 ′ perteneciente a la superfamilia DEDD de exonucleasas de ADN y ARN, llamada así por los aminoácidos con servados en tres motivos (I, II y III) 345 esenciales para la actividad de nucleasa de la nsp14. 254 Un quinto residuo, una histidina, se conserva cuatro aminoácidos secuencia arriba del último aspartato conservado en el motivo III, lo que convierte al dominio ExoN en un miembro de la subfamilia DEDDh de la superfamilia DEDD. Los cuatro resi duos ácidos son parte del sitio catalítico y forman dos sitios de unión a metales necesarios para la actividad catalítica. 344 El dominio ExoN también contiene un dominio similar a un dedo de zinc insertado entre los motivos I y II de las helicasas DEDDh. 345 Con base en la función de algunos miembros de la familia DEDD de exonucleasas en la corrección del ADN y la conservación de este dominio en coro navirus, torovirus y ronivirus, virus con genomas muy grandes de la familia Nidovirus , y su ausencia en los arterivirus más pequeños, se especuló que este dominio de la nsp14 podría tener un papel en la corrección del ARN o en el cambio de plantilla durante la síntesis del ARN subgenómico. 345 La caracterización bioquímica del dominio ExoN del SARS-CoV sobreexpresado y purificado mostró que la enzima dige ría sustratos de ARN monocatenario y bicatenario en la dirección prevista de 3 ′ a 5 ′ , pero no ADN. 254 El patrón de los productos de escisión obtenidos sugirió que las dianas de esta enzima podrían ser los ARN parcialmente monocatenarios. Como se indica en la sección sobre la nsp10, la unión de la nsp10 a la nsp14 estimula en gran medida la actividad de nucleasa del dominio ExoN de la nsp14. 230 Este complejo es capaz de llevar a cabo eficazmente la escisión de desajustes en el extremo 3 ′ de un dsRNA, una actividad coherente con un papel en la corrección del ARN. Además, se constató que el complejo era capaz de escindir remdesivir-molnupiravir (MP) del extremo 3 ′ de un sustrato de dsRNA sintético, lo que sugiere una función en la resistencia de los coronavirus a los análogos de nucleó sidos. 94 La coexpresión de la nsp10 y la nsp14 permitió la purifica ción de complejos nsp10-nsp14 y la determinación de su estructura mediante radiocristalografía. 230 La nsp14 contenía dos dominios, un dominio ExoN aminoterminal que abarcaba los aminoácidos 1-287 y un dominio de N 7–MTasa carboxiterminal que abarcaba los ami noácidos 288-527. La estructura definió la superficie de interacción nsp10-nsp14 mostrando que la nsp10 interactúa exclusivamente con el dominio ExoN. La estructura reveló que los residuos catalíticos de dicho dominio son D (ácido aspártico) 90, E (ácido glutámico) 92, E191 en lugar de la D conservada en la posición 243 en la nsp14 del SARS-CoV que se pensaba que formaba parte del sitio activo del ExoN, H (histidina) 268 y D273. La estructura también reveló dos dedos de zinc, el primero situado entre los motivos I y II y el segundo superpuesto al dominio III. Ambos son necesarios para la actividad de nucleasa. La interacción de la nsp14 con la nsp10 produjo un cambio en la conformación de la nsp14 que estabilizó el sitio activo del domi nio ExoN con un aumento concomitante de la actividad enzimática de dicho dominio. 94 Además de interactuar con la nsp10, la nsp14 interactúa con la nsp12 y con el complejo central de la RdRp formado por nsp7-nsp8 2 -nsp12, lo que sugiere que podría existir un complejo supermolecular de replicación-transcripción para llevar a cabo tanto la síntesis de ARN como la corrección de errores de ARN y las reac ciones enzimáticas necesarias para la formación de capuchones en

Copyright © 2024 Wolters Kluwer, Inc. Unauthorized reproduction of the content is prohibited.