9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

nsp13 elimina el fosfato γ del trifosfato en 5 ′ de los transcritos de ARN nacientes y el dominio NiRAN de la nsp12 parece proporcionar una actividad de guanililtransferasa para producir un GpppN en el extremo 5 ′ de los ARN recién sintetizados ( véanse las secciones previas sobre la nsp12 y la nsp13). Los dos pasos siguientes en la producción de un capuchón en 5 ′ son la adición de un grupo metilo en la posi ción N7 de la guanina por la actividad de N 7–MTasa de la nsp14 para producir una estructura Cap-0, seguida de una segunda reacción de metiltransferasa mediada por la nsp16, añadiendo grupos metilo a la posición 2 ′ - O del primer nucleótido de ARN (produce una estruc tura Cap-1) o al primer y segundo nucleótidos de ARN para producir una estructura Cap-2. La presencia de una estructura de capuchón en 5 ′ es esencial para el reconocimiento del mRNA por parte del fac tor 4E de iniciación de la traducción eucariota y, por lo tanto, para la traducción del ARN vírico y para la replicación, 93,95 y también des empeña un papel a la hora de evitar el reconocimiento por parte del sistema inmunitario innato. 445 Tanto la nsp14 como la nsp16 forman heterodímeros con la nsp10; estas interacciones y sus efectos funciona les se describen con más detalle a continuación. Nsp10 Las nsp10 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 miden 139 aminoácidos de longitud y son escindidas proteolíticamente de su precursor pp1ab por el dominio Mpro de la nsp5. 345 Las dos proteínas son idénticas en un 99.3% en la secuencia de aminoácidos; las dos diferencias son un cambio no conservador de una prolina (SARS-CoV) a una ala nina (SARS-CoV-2) en la posición 23 y un cambio conservador de arginina (SARS-CoV) a lisina (SARS-CoV-2) en el aminoácido 113. La nsp10 desempeña un papel importante en la replicación vírica y la síntesis de ARN, como se mostró en un análisis bioquímico de un mutante del MHV sensible a la temperatura, tsLA6, que se asignó a la nsp10 mediante la secuenciación del mutante y los revertientes espon táneos 315 y mediante experimentos de genética inversa con el MHV y el SARS-CoV. 29,79 En una prueba de doble híbrido en levadura de las 16 proteínas codificadas por el ORF1ab del SARS-CoV se mostró que la nsp10 podía autoasociarse e interactuaba fuertemente con la nsp14 y la nsp16. 152 La radiocristalografía de la nsp10 purificada del SARS-CoV proporcionó una estructura de dominio único compuesta por dos hélices α antiparalelas aminoterminales apiladas contra un núcleo de lámina β y tres regiones helicoidales α adicionales seguidas por un extremo C enrollado. 165 La proteína contiene dos dedos de zinc conservados; en el MHV se ha constatado que estos desempeñan un papel esencial en la síntesis de ARN. 79 Se cree que un grupo de ami noácidos básicos en su superficie media su modesta actividad de NAB monocatenaria y bicatenaria. 165 Se han determinado las estructuras de los heterodímeros nsp10-nsp1 671 y nsp10-nsp14 230 del SARS-CoV y se han trazado las superficies de interacción para ambos mediante sus estructuras radiocristalográficas. La interacción de la nsp10 con la nsp14 es exclusivamente con el dominio de exonucleasa de la nsp14 y activa considerablemente la actividad de exonucleasa de la nsp14. 230 Las superficies de interacción de la nsp10 con estas dos proteínas se solapan parcialmente, lo que descarta que una única molécula de la nsp10 interactúe de manera simultánea con la nsp14 y la nsp16. El papel funcional de estas interacciones se tratará con más detalle en las secciones sobre la nsp14 y la nsp16 más adelante. La estructura de la nsp10 del SARS-CoV-2 se ha resuelto mediante radiocristalografía y es prácticamente idéntica a las estructu ras determinadas para la nsp10 del SARS-CoV. 306 Las estructuras de la nsp10 en forma de complejos con la nsp14, 215,220 con la nsp16 307,378 y con un complejo ampliado de replicación-transcripción se han deter minado mediante estudios de crio-ME o radiocristalografía y se anali zarán más adelante.

contiene además la nsp9. 52,236,411,412 Aunque se han realizado múl tiples análisis computacionales y enzimáticos de inhibidores de las actividades de NTPasa y de helicasa, son relativamente pocos los que han investigado la replicación vírica en células infectadas y la infección de animales por el SARS-CoV-2. Antes de la pandemia de COVID-19, se habían identificado compuestos de bismuto como inhibidores de la actividad de helicasa de la nsp13 del SARS-CoV y de la replicación vírica en células infectadas. 416 El compuesto citrato de bismuto de ranitidina es un potente inhibidor de la acti vidad de helicasa de la nsp13 purificada del SARS-CoV-2 y de las actividades de NTPasa e inhibió la replicación vírica tanto en células infectadas como en hámsteres sirios infectados por el SARS-CoV-2, al tiempo que disminuía la gravedad de la neumonitis en estos ani males. 424 El tratamiento de la nsp13 purificada con compuestos de bismuto desplaza los iones de zinc del dominio de unión al zinc de la nsp13, lo que sugiere que esto altera la interacción de este dominio con la helicasa enzimáticamente activa. Los estudios de crio-ME 52,417 de un complejo de replicación y transcripción (nsp7-nsp8 2 -nsp12 nsp13 2 ) con un cebador-plantilla de ARN parcialmente bicatenario mostraron que las dos moléculas de la nsp13 interactuaban a tra vés de sus dominios 1B. El dominio 1B de una molécula de la nsp13, designada nsp13-1 , se unió al dominio de interfase de la nsp12 (une los dominios RdRp y NiRAN), mientras que su dominio ZBD se unió a la nsp8-1. El dominio ZBD de la segunda molécula de la nsp13, designada nsp13-2 , se unió al dominio helicoidal de la nsp8-2 y al dominio de pulgar de la RdRp, mientras que su dominio 1B estableció contactos adicionales con la nsp8-2. La ampliación en 5 ′ no emparejada del ARN de plantilla sobresale del sitio catalítico de la nsp12 hacia el canal de unión al ARN de la nsp13-2. 52,236,411 Cabe señalar que, como la RdRp de la nsp12 avanza a lo largo del ARN de plantilla en dirección 3 ′ a 5 ′ y la helicasa de la nsp13 desenrolla el ARN en dirección 5 ′ a 3 ′ , los movimientos de estas dos moléculas a lo largo del ARN de plantilla se oponen entre sí. Si la helicasa preva lece, la RdRp se moverá retrógradamente en la plantilla, 52,236 un pro ceso llamado retroceso ( backtracking ). Las simulaciones de dinámica molecular sugieren que uno o más nucleótidos mal incorporados en el extremo 3 ′ en alargamiento del ARN recién sintetizado se separa rán espontáneamente de la plantilla y entrarán en el túnel de unión a nucleótidos de la RdRp, un resultado apoyado por experimentos de entrecruzamiento ARN-proteína. 236 Los estudios estructurales apo yan un modelo en el que el motivo F de la RdRp proporciona una estructura separadora de cadenas que dirige el extremo deshilachado del ARN en alargamiento hacia el túnel de unión a nucleótidos durante el retroceso. Se ha sugerido que el retroceso desempeña un papel en el acontecimiento de cambio de plantilla que es fundamen tal para la unión del cuerpo líder, un paso esencial en la transcripción de los coronavirus. 236 También se ha sugerido que esto proporciona un mecanismo para extruir un ARN en alargamiento con un nucleó tido mal incorporado o un análogo de nucleótido a través del túnel de ingreso de nucleótidos, proporcionando acceso a la exonucleasa nsp14 que brinda una función de corrección de errores para la sín tesis de ARN de los coronavirus ( véase la sección sobre la nsp14 más adelante). Proteínas de la maquinaria de formación del capuchón de los coronavirus (nsp10, nsp14 y nsp16) Reacciones de formación del capuchón Hay cinco proteínas de los coronavirus implicadas en la adición de un capuchón en 5 ′ a los ARN específicos del virus de sentido positivo que son sintetizados por el complejo de replicación y transcripción: nsp13, nsp12, nsp14, nsp16 y nsp10. La actividad de NTPasa de la

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