9788419284617_Howley.Virus de ARN

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CAPÍTULO 21 • Coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2

proporciones de nsp7:nsp8:nsp12 de 1:2:1 y la actividad de polimerasa depende del centro catalítico de la nsp12. 351

conocidos como secuencias Walker A y B , necesarios para la unión y la hidrólisis del NTP. 324 Se parece mucho a las helicasas de la fami lia Upf1. 203 Los análisis bioquímicos de la nsp13 recombinante puri ficada de varios coronavirus, incluido el SARS-CoV, mostraron actividad tanto de NTPasa como de helicasa. 135,155,324 Los estudios con la nsp13 del HCoV-229E 324 y del SARS-CoV 155 establecieron que la helicasa era capaz de desenrollar dúplex de ADN y ARN con extre mos 5 ′ salientes en dirección 5 ′ a 3 ′ . La presencia de un sustrato para la helicasa estimulaba enormemente su actividad de NTPasa y una mutación K288A en el motivo I que interfería con la unión a NTP suprimía tanto la actividad de NTPasa como la de helicasa, propor cionando pruebas de que la actividad de NTPasa brindaba la energía para que la nsp13 desenrollara los dúplex de ARN. Una investigación más detallada de la actividad de NTPasa mostró que era capaz de hidrolizar el trifosfato en 5 ′ de una molécula de ARN monocatenario para producir un ARN con un difosfato en 5 ′ . La hipótesis es que esta actividad de NTPasa en 5 ′ lleva a cabo el primer paso en la síntesis del capuchón en 5 ′ que se encuentra en los mRNA y en el genoma de los coronavirus. Una mutación K288A suprimió esta actividad de trifosfatasa, así como las actividades de NTPasa y de helicasa. Un análisis cinético de la actividad de helicasa de la nsp13 mostró que el desenrollamiento de un dúplex de ácido nucleico tenía lugar en pasos separados de 9.3 nucleótidos a una velocidad de 30 pasos por segundo, y la adición de la nsp12 a la reacción duplicaba el tamaño del paso aumentando así la velocidad de desenrollamiento dos veces, lo que sugiere una asociación entre las dos proteínas. 1 En el 2017 y el 2019 se determinaron las estructuras de las moléculas de la nsp13 del MERS-CoV y el SARS-CoV, respectivamente. 133,160 Ambas molé culas eran dímeros en la unidad asimétrica cristalográfica, aunque los dímeros se empaquetaban de forma diferente en las dos estructuras. Las estructuras de las dos enzimas eran muy similares y ambas con tenían cinco dominios: un NTD rico en Cys-His que une tres áto mos de zinc (designado dominio ZBD o CH ) y que corresponde al dominio ZF identificado bioinformáticamente, 110,345 un dominio de tallo helicoidal α , un dominio de barril β (designado dominio 1B ) seguido de dos dominios similares a RecA designados RecA1 (resi duos 241-443) y RecA2 (residuos 444-596). Estos dominios están dispuestos de tal modo que forman una molécula piramidal, con los dos dominios RecA que contienen los siete primeros motivos centra les de la familia SF1 de helicasas más el dominio 1B formando la base de la pirámide, el dominio del tallo helicoidal α situado encima de los dominios RecA1 y Rec1B y el dominio de unión a zinc situado encima del tallo helicoidal α . Los siete motivos conservados de la familia SF1 de helicasas están situados en una hendidura entre los dos dominios similares a RecA, y esta hendidura contiene el bolsi llo de unión a nucleótidos. La comparación de la estructura de la nsp13 con la de la helicasa de los arterivirus y la helicasa Upf1 sugiere que el extremo 3 ′ de un ARN monocatenario unido se encuentra en un túnel de 6-12 Å de ancho formado por los dominios 1B, de tallo y RecA1, mientras que el extremo 5 ′ del ARN se encuentra sobre el dominio RecA2. En el 2019 se identificó un sitio de unión para la nsp12 en las superficies adyacentes de los dominios ZBD y 1B de la nsp13. 133 Los estudios de mutagénesis con la nsp13 del HCoV-229E y una nsp10 de arterivirus relacionado indicaron que un dominio ZBD intacto y funcional era esencial para la actividad de adenosina–trifosfatasa y de helicasa y, por lo tanto, para la replicación vírica. 324 Como era de esperarse, un compuesto que inhibía la activi dad desenrolladora de la helicasa del SARS-CoV también inhibía la replicación de un replicón de ARN del SARS-CoV. 2 Los estudios de la nsp13 del SARS-CoV-2 se han centrado en la identificación de inhibidores de las actividades de NTPasa y de helicasa 424 o han sido estudios de crio-ME de la nsp13 en forma de complejo con el complejo de replicación y transcripción (nsp7 nsp8 2 -nsp12-nsp13 2 ) o en un complejo de replicación ampliado que

Nsp9 La nsp9 es una proteína de 113 aminoácidos que es un compo nente de los complejos ampliados de transcripción y replicación. 412 La proteína es liberada de los polipéptidos precursores pp1a y pp1ab por el dominio Mpro de la nsp5. 74,345 En células infectadas por el MHV, la nsp9 se localizó en las DMV junto con otros componen tes de la maquinaria replicativa. 27 Las secuencias de las proteínas del SARS-CoV y el SARS-CoV-2 son idénticas en un 97.3% y la proteína del SARS-CoV sobreexpresada bacteriológicamente se cristalizó y se determinó su estructura tridimensional. 88,354 La nsp9 estaba dimeri zada en la estructura cristalina y cada molécula de esta proteína tenía la conformación general de un barril β cónico de seis cadenas con bucles salientes flanqueados por una hélice α carboxiterminal unida al barril β a través de interacciones hidrófobas. La cara externa de la hélice es la interfase de dimerización entre dos moléculas de la nsp9. Las mediciones de dispersión dinámica de la luz sugirieron que la nsp9 era dimérica en solución, mientras que la cromatografía de permea ción en gel sugirió que la nsp9 era monomérica en solución. El análi sis de equilibrio de sedimentación sugirió que el dímero y las formas monoméricas de la nsp9 estaban en equilibrio entre sí. 354 Otros experi mentos que emplearon mutagénesis dirigida al sitio mostraron que un motivo GXXXG de interacción conservado de la proteína que abar caba los residuos 100-104 era crítico para la dimerización y crucial para la replicación exitosa del virus. 250 La dimerización coloca un par che de aminoácidos básicos en cada monómero adyacente entre sí pro porcionando un área de alto potencial electrostático para servir como región de unión para el ARN. Los estudios de resonancia plasmática superficial y de desplazamiento de movilidad electroforética mostraron que la nsp9 era una proteína de unión al ARN monocatenario. 88,354 Con la llegada de la pandemia de COVID-19, la nsp9 del SARS-CoV-2 fue sobreexpresada, purificada y cristalizada y su estruc tura determinada por medio de radiocristalografía bastante pronto en el curso de la pandemia. 217 La cromatografía de permeación en gel mostró que la proteína purificada era un dímero en solución y que su afinidad por los oligonucleótidos cortos polyU o polyT era muy baja. La estruc tura de la nsp9 del SARS-CoV-2 era muy similar a la de la molécula del SARS-CoV, como cabía esperar debido a su alto grado de identidad de secuencia. Como ya se ha señalado, la nsp9 es una diana para la activi dad de nucleótido–transferasa catalizada por el dominio NiRAN de la nsp12, lo que resulta en la NMPilación del residuo de asparagina ami noterminal de la nsp9, que es vital para la replicación del virus. 342 El análisis por crio-ME de un complejo replicasa-transcriptasa ampliado que consiste en nsp7-nsp8 2 -nsp9-nsp12-nsp13 2 mostró que la nsp9 estaba posicionada con su extremo N cerca del centro catalítico del dominio NiRAN de la nsp12. 412 Nsp13 La nsp13 es una proteína de 601 aminoácidos que es un compo nente de los complejos ampliados de transcripción y replicación. 412 La nsp13 del SARS-CoV-2 es idéntica en un 99.8% a la nsp13 del SARS-CoV; solo difiere de la nsp13 del SARS-CoV en el residuo 570, donde una valina es sustituida por una isoleucina. Es liberada del polipéptido precursor pp1ab por el dominio Mpro de la nsp5 74,345 y se localiza en las DMV, junto con otros componentes de la maquinaria replicativa. 77,155 La nsp13 contiene dominios de helicasa carboxiter minal y de dedo de zinc (ZF, zinc finger ) aminoterminal identifica dos mediante análisis bioinformáticos de los genomas del IBV y del SARS-CoV. 110,345 El dominio de helicasa contiene 11 motivos asocia dos con la familia SF1 de helicasas, siendo los motivos I y II, también

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