9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

función de cebado de proteínas para la síntesis de ARN de cadena negativa. Un conjunto posterior de experimentos con las nsp12 del HCoV-229E y el SARS-CoV-2 mostró que la actividad de nucleotidil transferasa del dominio NiRAN era mucho mayor cuando se le pro porcionaba nsp9 como sustrato, que la asparagina aminoterminal de la nsp9 era la diana de la reacción de transferencia de nucleótidos y que esto era vital para la replicación del virus. 342 Estudios recientes con la nsp12 del SARS-CoV-2 mostraron que, en presencia de la nsp13, una proteína que se une a la nsp12 ( véase el análisis sobre los complejos de replicación-transcripción más adelante) y que contiene actividad tanto de helicasa como de NTPasa, el dominio NiRAN era capaz de trans ferir GMP al ppA-RNA. Así pues, el dominio NiRAN de la nsp12 parece ser capaz de funcionar como una guanilil–transferasa, llevando a cabo uno de los primeros pasos en la síntesis de un capuchón en 5 ′ . 412 Esta actividad se vio disminuida por la adición de la nsp9 al complejo. Las actividades de RdRp y de nucleotidiltransferasa que pre senta la nsp12 son objetivos atractivos para los antivirales. Antes del brote de COVID-19, el remdesivir (GS-5734), un profármaco de un análogo de nucleósido de la adenina (GS-441524) y un inhibi dor de amplio espectro de la RdRp vírica, mostró ser un inhibidor eficaz de la replicación de los coronavirus en cultivo celular y pro tector en un modelo de ratón del SARS. 328 Su actividad contra los coronavirus es notable, ya que la mayoría de los demás análogos de nucleósidos son relativamente ineficaces debido a la actividad correc tora de la exonucleasa nsp14 de los coronavirus ( véase la sección sobre la nsp14 más adelante). 3 Con la llegada de la pandemia de COVID-19, el remdesivir o su forma trifosfato bioquímicamente activa mostró con rapidez ser un inhibidor eficaz de la RdRp del SARS-CoV-2 en análisis bioquímicos 114 y de la replicación del SARS-CoV-2 en cul tivo celular; 298,391 además, mostró eficacia en modelos de ratón 298 y de macaco 400 para COVID-19. La incorporación del remdesivir en un ARN alargado por la RdRp del SARS-CoV-2 produce una termina ción retardada de la cadena de síntesis de ARN en la posición + 3, tres nucleótidos después del sitio de incorporación del remdesivir, 114 similar al mecanismo observado en los coronavirus del SARS y el MERS. 111 La estructura de crio-ME del dominio RdRp en conjunto con un ARN alargador en presencia del remdesivir mostró un choque estérico con la Ser861 de la nsp12 que impedía la incorporación de un cuarto nucleótido tras el monofosfato de remdesivir incorporado. 185,421 La mutación de la Ser861 a una glicina menos voluminosa elimina la terminación de la cadena. 357 Se ha propuesto un segundo mecanismo de acción en el que el remdesivir que se ha incorporado a un ARN alargado con éxito actúa como una plantilla deficiente para las ron das posteriores de síntesis de ARN debido al posicionamiento inco rrecto del monofosfato de remdesivir incorporado en el sitio activo de la RdRp. 357 El pase del SARS-CoV y el MHV en cultivo celular en presencia del remdesivir dio lugar a la acumulación de virus mutantes que habían adquirido resistencia al fármaco. Estas mutaciones fueron F480L y V557L en la RdRp del SARS-CoV. 3 Ambas mutaciones se encuentran en el subdominio de dedos de la RdRp, y V557L está en el motivo F de la RdRp, que forma un canal para los NTP entrantes, lo que sugiere que la mutación puede afectar la fidelidad de la RdRp. La pandemia de COVID-19 dio lugar a una serie de estudios computacionales y de alto rendimiento para identificar posibles inhi bidores de la replicación del SARS-CoV-2. Múltiples análogos de nucleósidos usados en la actualidad como antivirales para otros virus de ARN se probaron al igual que sus derivados trifosfato como inhi bidores del alargamiento del cebador por el complejo central de la polimerasa del SARS-CoV-2. 55 Los derivados trifosfato del sofosbu vir, el tenofovir, la alovudina y el abacavir son incorporados en el ARN en alargamiento por la RdRp y terminan el alargamiento adi cional. El sofosbuvir ha mostrado tener actividad en la inhibición de la replicación del SARS-CoV-2 en cultivos celulares, al igual que el daclatasvir, un segundo inhibidor nucleósido de la replicación del

virus de la hepatitis C. 312 Un metaanálisis de una serie de pequeños ensayos clínicos del sofosbuvir en combinación con el daclatasvir en pacientes con COVID-19 sugirió que esta combinación mejoraba la supervivencia y acortaba el tiempo hasta la recuperación clínica, 339 aunque el modesto número de pacientes incluidos en los ensayos y las diferencias en el diseño de estos impidieron extraer conclusiones definitivas sobre la eficacia. Otros tres análogos de nucleósidos, el favi piravir, la β -D-N 4 -hidroxicitidina (EIDD-1931) y un profármaco de la EIDD-1931, EIDD-2801, inhiben la replicación de los coronavirus mediante un mecanismo diferente, induciendo un aumento de la tasa de mutaciones de transición en los genomas en replicación, lo que pro duce una catástrofe de errores. 4,327,329 La EIDD-2801 (molnupiravir) se desarrolló para hacer frente al rápido catabolismo de la EIDD-1931 en el intestino de primates no humanos. 281 La EIDD-2081 mejoró la fun ción pulmonar, redujo la concentración vírica en los pulmones y dis minuyó la pérdida de peso en modelos de ratón del SARS y el MERS así como en modelos de ratón y hámster de COVID-19. 308,329,385 La EIDD-2801 puede administrarse por vía oral, fue eficaz en estudios preclínicos y redujo la hospitalización en personas infectadas por el SARS-CoV-2. 281 Nsp7 y nsp8 Estas dos proteínas relativamente pequeñas (83-198 aminoácidos) for man parte de la maquinaria de replicación y transcripción del ARN de los coronavirus y se localizan en el compartimento de DMV de replicación del ARN en las células infectadas por coronavirus. 27 Son liberadas de los polipéptidos precursores pp1a y pp1ab por el domi nio Mpro de la nsp5. 74,345 La nsp7 y la nsp8 están muy conservadas, con una identidad de secuencia del 98.8% y el 97.5% entre las proteí nas respectivas del SARS-CoV y el SARS-CoV-2. Las estructuras de la nsp7 del SARS-CoV se han determinado mediante RM 290 y por radio cristalografía, 428 con esta última estructura como un complejo hexade camérico en forma de anillo ensamblado in vitro que consiste en ocho moléculas de la nsp7 en forma de complejo con ocho moléculas de la nsp8. La nsp7 contiene cuatro hélices α en ambas estructuras, aun que las hélices están orientadas de forma algo diferente en el espacio en las dos estructuras. Las moléculas de la nsp8 en el complejo hexamé rico adoptan dos conformaciones. La primera por lo general se ha des crito como un palo de golf con el eje aminoterminal (residuos 6-104) formado por tres hélices y la cabeza carboxiterminal formada por un barril β y tres segmentos helicoidales plegados en un dominio hidró fobo apretado. En la segunda conformación de la nsp8, descrita como un palo de golf doblado, la hélice más larga del dominio del eje con tiene una curva y, por lo tanto, está dividida en dos segmentos heli coidales más cortos. 428 En el complejo en forma de anillo, la superficie interior de este anillo está cargada positivamente y proporciona una superficie para la unión del dsRNA con las hélices largas de la nsp8 que interactúan con el ARN. Como ya se mencionó, se mostró que la nsp8 recombinante purificada del SARS-CoV tiene una actividad de ARN-polimerasa dependiente de la plantilla que produce productos de ARN cortos, de seis nucleótidos de longitud, y se ha sugerido que actúa como primasa para la RdRp de la nsp12. 151 La formación del complejo de la nsp8 con el nsp7 estimula esta actividad de polimerasa y también permitió a la nsp8 realizar la síntesis de ARN de ampliación de cebador, así como la síntesis de ARN de novo antes descrita, aunque seguía siendo unas 20 veces menos activa que la RdRp de la nsp12. 359 Las mutaciones de residuos básicos en el eje helicoidal de la nsp8 supri mieron la unión al ARN y la actividad de polimerasa, y la mutagénesis de los motivos D/ExD/E conservados identificó residuos en el NTD helicoidal de la nsp8 necesarios para la actividad de polimerasa del complejo. 359,428 Hay que tener en cuenta que la relevancia fisiológica de la estructura hexadecamérica en forma de anillo en la replicación vírica no está clara, ya que los complejos formados con la nsp12 tienen

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