9788419284617_Howley.Virus de ARN

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CAPÍTULO 21 • Coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2

nucleotidiltransferasa asociada con la RdRp de nidovirus (NiRAN, nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase ) que se encuentra en todas las proteínas RdRp de los nidovirus, y un dominio RdRp car boxiterminal de 500 aminoácidos; estos dos dominios están unidos por una región conectora. 204 El dominio RdRp de los coronavirus tiene una estructura similar a la de otras RdRp víricas y puede describirse como semejante a una mano derecha en forma de copa con una región de pulgar, los dedos y una palma, y contiene un motivo SDD conservado como parte del sitio activo de la polimerasa en lugar del motivo GDD que se encuentra en la mayoría de las otras RdRp, así como los otros siete motivos (A-G) asociados con la actividad de RdRp. 110,180,409 La nsp12 recombinante purificada del SARS-CoV tiene un grado muy modesto de actividad de polimerasa in vitro con una procesividad baja cuando se presenta con un ARN de plantilla que se ha reasociado con un cebador de ARN. 358 Un complejo de la nsp12 con la nsp8 y la nsp7 aumentó enormemente la actividad de polimerasa y la procesividad. 351 Este complejo tetramérico consiste en una molécula de la nsp12 unida a un heterodímero nsp7-nsp8 y una única molécula de la nsp8. El complejo muestra tanto un inicio de novo de la síntesis de ARN inde pendiente del cebador como actividad de RdRp dependiente del ceba dor; ambas actividades dependen de la presencia de un sitio catalítico intacto en el dominio RdRp de la nsp12. 351 La nsp12 del SARS-CoV era resistente a la cristalización, pero su estructura se determinó en el 2019 por crio-ME del complejo de la nsp12 unido a la nsp7 y la nsp8 (fig. 21-10). 180 En esta estructura, el dominio NiRAN aminoterminal y el dominio conector (interfase) hacen contacto con el dominio RdRp en la superficie externa de los dedos y la base de los subdominios palmares. Se identificaron canales de ingreso y salida de ARN en el dominio RdRp, así como el canal de unión a NTP. Además, se identi ficaron dos sitios de unión a metales previamente insospechados, uno en el dominio conector (H295-C301-C306-C310) y el segundo en el subdominio de dedos de la RdRp (C487-H642-C645-C646). Aunque se encontró zinc ligado a estos sitios de unión a metales en la estruc tura generada por crio-ME, trabajos posteriores 233 mostraron que estos sitios de unión a metales estaban ocupados por agregaciones de Fe-S en células infectadas, que la unión de las agregaciones de Fe-S a la RdRp es esencial para la actividad de polimerasa y que el tratamiento de células

infectadas con un compuesto que oxida y desensambla las agregaciones de Fe-S inhibía fuertemente la replicación del SARS-CoV-2 en células infectadas. El heterodímero nsp7-nsp8 se une por encima del subdo minio de dedos del dominio RdRp y la segunda molécula de la nsp8 contacta con la nsp12 en la superficie exterior cerca de la parte superior del subdominio de dedos del dominio RdRp y en el dominio conector, que es adyacente al subdominio de dedos de la RdRp. El complejo de la nsp12 con la nsp7 y la nsp8 es la estructura central de la maquina ria de replicación de los coronavirus. Proporciona una plataforma para complejos más grandes que contengan nsp adicionales implicadas en la síntesis y la modificación del ARN y se ha utilizado en análisis de inhi bidores potenciales de la RdRp ( véase más adelante). El dominio NiRAN de la nsp12 es exclusivo de los nidovirus y fue caracterizado por primera vez por Lehmann y cols. 204 Este dominio está conservado en todos los nidovirus, y un análisis bioinformático identificó tres motivos conservados designados A N , B N y C N . El domi nio NiRAN tiene una actividad de nucleotidiltransferasa con preferen cia por el trifosfato de uridina (UTP, uridine triphosphate ) sobre otros trifosfatos de nucleótidos. 204,342 Cuando la nsp12 del SARS-CoV fue incubada con un sustrato de UTP o trifosfato de guanosina (GTP, guanosine triphosphate ), esta actividad transfirió un monofosfato de uridina (UMP, uridine monophosphate ) o monofosfato de guanosina (GMP, guanosine monophosphate ) al grupo amino ε de un residuo de lisina conservado en el aminoácido 73 en la nsp12 del SARS-CoV mediante la formación de un enlace fosforamidato. En este análisis, hubo una fuerte preferencia por el UTP sobre el GTP y no se utili zaron otros trifosfatos de nucleótidos. Se mostró que la actividad de transferasa es esencial para la replicación de los nidovirus mediante una serie de experimentos de genética inversa con el SARS-CoV y para el arterivirus relacionado, el virus de la arteritis equina, en los que no se pudieron recuperar virus infecciosos portadores de mutaciones en los residuos conservados en los motivos A N , B N y C N necesarios para la actividad de transferasa. Se propusieron tres posibles funciones para esta actividad de transferasa: podría funcionar como una ARN-ligasa, podría proporcionar la actividad de guanililtransferasa aún no iden tificada necesaria para la formación del capuchón en 5 ′ o, mediante la transferencia de un UMP a una proteína diana, podría tener una

FIGURA 21-10 Estructura del complejo nsp12-nsp7-(nsp8)2 del SARS-CoV. La nsp12 del SARS-CoV contiene una gran extensión a minoterminal compuesta por el dominio NiRAN ( rojo oscuro ) y un dominio de interfase ( púrpura ) adyacente al dominio de polimerasa ( naranja ). La nsp12 se une a un heterodímero de nsp7 ( azul ) y nsp8 ( verde ), así como a una segunda subunidad de la nsp8 (adaptada de Kirchdoerfer RN, Ward AB. Structure of the SARS-CoV nsp12 polymerase bound to nsp7 and nsp8 co-factors. Nat Commun 2019;10(1):2342. https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

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