9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

Complejo de la replicasa: nsp7-nsp16 Panorama general La replicación y la transcripción del ARN de los coronavirus es un pro ceso complejo que requiere una maquinaria enzimática capaz de llevar a cabo el proceso de transcripción discontinua de los coronavirus y de replicar el amplísimo genoma coronavírico. Las nueve proteínas que lle van a cabo estos procesos, nsp7-nsp10 y nsp12-16, desempeñan una serie de funciones enzimáticas y no enzimáticas (resumidas en la tabla 21-1) y se han colocalizado en las DMV que son el sitio de síntesis del ARN coronavírico en la célula. 27,77,115,127 Durante el brote del SARS-CoV del 2002-2003, muchas de las actividades enzimáticas se predijeron mediante un análisis bioinformático comparativo antes de constatarse bioquímicamente. 345 La nsp12 contiene los siete motivos de secuencia típicos (A-G) de una RdRp 110,409 y se ha informado que tiene activi dad de RdRp dependiente de cebador 358 e independiente de cebador. 6 Los análisis bioinformáticos de la nsp12 sugirieron que carecía de los bucles de cebado necesarios para posicionar los trifosfatos de nucleósi dos (NTP, nucleoside triphosphate ) para iniciar la síntesis del ARN, y la comparación de secuencias la agrupó con RdRp dependientes de ceba dor como la 3Dpol picornavírica con base en la presencia o ausencia de un motivo implicado en el reconocimiento de cebador. 409 Otras nsp con actividades enzimáticas identificadas en la síntesis y la modificación del ARN de los coronavirus son la nsp13, que tiene actividades de helicasa en 5 ′ -3 ′ y de nucleótido–trifosfatasa; 155 la nsp14, que tiene una actividad de N 7–metiltransferasa ( N 7–MTasa) que metila la posición N7 de la guanosina en el capuchón en 5 ′ de los ARN víricos de sentido positivo produciendo una estructura Cap-0, 50 así como una actividad de exorri bonucleasa en 3 ′ -5 ′ que lleva a cabo una función de corrección de erro res durante la síntesis del ARN de los coronavirus; 84,254 y la nsp16, que tiene una actividad de 2 ′ - O –metiltransferasa (2 ′- O –MTasa) que metila la posición 2 ′ - O de la ribosa del primer nucleótido del extremo 5 ′ de los mRNA de los coronavirus para formar una estructura Cap-1. 70 La nsp15 tiene una actividad de endorribonucleasa, que cuando se expresa escinde el ARN bicatenario (dsRNA, double-stranded RNA ) con una fuerte preferencia por los residuos de U. 156 Los mutantes con la nsp15 catalíticamente inactiva promueven una mayor acumulación de dsRNA y la consiguiente activación de las vías antivíricas inmunitarias innatas, incluidas la producción y la señalización de IFN, las vías oligoadenilato– sintetasa (OAS)/RNasa L y la proteína–cinasa R (PKR, protein kinase R ); se ha informado que tales mutantes tienen defectos de modestos 170 a graves 179 en la replicación vírica. 170 Aunque se desconocen los mecanis mos exactos que subyacen a las funciones de la nsp15 en la evasión de la respuesta inmunitaria innata del hospedero, se ha propuesto que actúa degradando poli (U) en los ARN de cadena negativa 126 o degradando los ARN genómicos de sentido positivo 10 . Se ha informado que la nsp8 tiene una actividad de RdRp que sintetiza, de forma independiente del cebador, oligorribonucleótidos cortos y, por lo tanto, se especuló que funcionaba como una cebasa para la síntesis del ARN de la nsp12. 151 Trabajos posteriores con un complejo de nsp7, nsp8 y nsp12 han puesto en duda esta conclusión ( véase más adelante). 351 Las nsp7, nsp9 y nsp10 carecen de actividades enzimáticas, pero forman varios complejos dife rentes con la nsp8, la nsp12, la nsp13, la nsp14 y la nsp16 y tienen importantes funciones reguladoras en la síntesis y la modificación del ARN de los coronavirus. 344 Proteínas del complejo central de la replicasa-transcriptasa (nsp12, nsp8 y nsp7) Nsp12 Las nsp12 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 miden 932 aminoá cidos de longitud y son escindidas proteolíticamente de su precur sor pp1ab por el dominio Mpro de la nsp5. 345 Ambas proteínas son idénticas en un 96.4% en la secuencia de aminoácidos. La nsp12 con tiene dos dominios, un NTD de 300 aminoácidos, el dominio de

identificaron el inflamosoma que contiene el dominio de pirina 12, un regulador negativo de la liberación de citocinas inflamatorias; la TAB1, otro regulador de la respuesta inflamatoria; y la NRP, como dia nas potenciales para la escisión por parte de la Mpro. 256 Las concentra ciones de ambas proteínas disminuyeron en las células 293 infectadas por el SARS-CoV-2 y que expresaban la ACE2, lo que concuerda con el hecho de que estas proteínas son la diana de la Mpro, aunque no se informaron productos específicos de escisión de la Mpro. 256 Debido a su papel esencial en la replicación vírica y a la infor mación estructural disponible, la Mpro ha sido una diana terapéutica para el SARS-CoV, el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 ( véase la ref. 219). La Mpro coronavírica se encuentra bien conservada y se han desarro llado algunos compuestos extremadamente activos que inhiben la Mpro de múltiples coronavirus. Por lo general, los inhibidores pueden clasi ficarse como peptidomiméticos, que se unen a los bolsillos de unión al sustrato S1, S2, S3 y S1 ′ , o inhibidores alostéricos, que se unen a otros sitios y alteran los sitios de la interfase de unión al sustrato. 219 Los compuestos peptidomiméticos pueden contener cetonas, cetoamidas, aldehídos o receptores Michael como moléculas reactivas, que se unen covalentemente a la cisteína del sitio activo, o ser inhibidores reversi bles no covalentes. Antes de la pandemia de COVID-19, se desarrolla ron varios inhibidores de la Mpro que inhiben la replicación vírica en cultivos celulares; varios de ellos también tenían una amplia actividad anticoronavírica. 9,24,175,176,415 El compuesto GC376, un aducto bisufito de un inhibidor de la Mpro dipepitil-aldehído (GC373), ha mostrado ser un inhibidor eficaz de la replicación de múltiples coronavirus 175,176 y se ha utilizado para tratar con éxito una infección mortal de gatos por el coronavirus felino, el virus de la peritonitis infecciosa. 177 También se ha utilizado un derivado del GC376 para proteger a ratones que expre san el receptor humano del MERS-CoV de una infección mortal por el MERS-CoV e inhibir la replicación del SARS-CoV-2 en cultivos de célu las primarias de las VRH 301 y en células Vero. 382 El PF-07321332 374,436 es un inhibidor oral de la Mpro que contiene una ojiva de nitrilo ( véase fig. 21-9B), que, cuando se combinó con el ritonavir, mostró reducir la hospitalización en personas infectadas por el SARS-CoV-2 en el análisis provisional del ensayo clínico de fase 2/3 EPIC-HR (NCT04960202). 280 Un tercer inhibidor peptidomimético de la Mpro desarrollado contra el SARS-CoV, el N3, 415 contiene una ojiva de receptor Michael y tam bién es activo contra el SARS-CoV-2. 164 Un análisis radiocristalográfico de una farmacoteca y un acervo de compuestos similares identificó dos inhibidores alostéricos, que se unían en la interfase del dímero de Mpro o cerca de ella, lo que producía un estrechamiento de la hendidura de unión al sustrato y alteraba el sitio de unión al sustrato. 124 Los análisis computacionales y bioquímicos de farmacotecas y acervos de productos naturales aprobados o en investigación identificaron varios inhibidores adicionales de la Mpro del SARS-CoV-2, los cuales también inhibían la replicación del SARS-CoV-2. 164 Entre ellos se encuentran la cinanse rina, un antagonista de la serotonina; el disulfiram, un inhibidor de la aldehído–deshidrogenasa utilizado para tratar el alcoholismo; el ebselem, un compuesto selenorgánico; y el carmofur, un derivado del 5-fluorou racilo (5-FU) empleado como fármaco quimioterápico. La cinanserina 48 había sido identificada previamente como un inhibidor de la enzima del SARS-CoV y era un antiviral eficaz en cultivo de tejidos. Los inhibidores de otras proteasas víricas, como el boceprevir, un inhibidor cetoaminér gico de la proteasa ns3 del virus de la hepatitis C, también son efica ces contra la Mpro del SARS-CoV-2. 100 El lopinavir, un medicamento dirigido a la proteasa del virus de la inmunodeficiencia humana, tam bién inhibió la Mpro del SARS-CoV y la replicación del SARS-CoV in vitro y tuvo una eficacia modesta en un ensayo clínico abierto durante el brote del SARS-CoV del 2002-2003. 56,403 No obstante, un ensayo clínico durante el brote de COVID-19 indicó que este fármaco no era eficaz en pacientes hospitalizados. 39 También se han registrado ensayos clínicos con el ebselem (NCT04484025 y NCT04483973) y el disulfi ram (NCT04485130) en ClinicalTrials.gov.

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