Howley. Virología ADN_7ed

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Virología. Volumen 2. Virus de ADN

tratamiento con grandes cantidades de calcio 14 o mediante la suspen- sión en medio semisólido. 218 Estos tratamientos estimulan la expre- sión de genes intermedios, la amplificación del ADN vírico y alguna expresión de genes tardíos, pero no la producción de partículas víricas El ciclo de vida completo del virus puede recapitularse en queratinocitos cultivados utilizando un sistema de cultivo organotí- pico «RAFT». En este sistema, los queratinocitos que contienen un genoma de HPV se cultivan en la superficie de contacto aire-líquido en un equivalente dérmico (p. ej., un gel de colágeno que contenga fibroblastos). 174 Esto induce la formación de un epitelio escamoso completamente estratificado que puede utilizarse para analizar varios aspectos de la biología, la genética y la bioquímica del HPV, así como para producir sus viriones (fig. 2-15). La especificidad de especie de los PV ha limitado el estudio del HPV en modelos animales, pero un primer enfoque para la propa- gación del HPV fue exponer células epiteliales primarias cultivadas

al virus y colocarlas bajo la cápsula renal de ratones desnudos. 112 Este sitio inmunológicamente protegido puede soportar el crecimiento de células heterólogas y fomentar la formación de un epitelio multicapa que se asemeja a un epitelio escamoso estratificado. El enfoque de los xenoinjertos permitió propagar con éxito varios tipos de HPV, aun- que es demasiado engorroso para el aislamiento rutinario del virus o para el análisis molecular o bioquímico de su replicación. Se han desarrollado vectores de transferencia de genes de papi- lomavirus, también conocidos como seudoviriones , que se utilizan ampliamente para los estudios de la entrada vírica y ensayos de neutralización in vitro . 34 El procedimiento más empleado implica la transfección paralela de plásmidos que expresan genes L1 y L2, modificados por codones junto con un plásmido informador ( repor- ter ) que contiene el origen de replicación del SV40 dentro de células que expresan el antígeno T del SV40 (por lo regular, 293TT). Las proteínas L1 y L2 empaquetan los plásmidos informadores amplifi- cados y los seudovirus purificados (que expresan genes marcadores como GFP o fosfatasa alcalina secretada) se utilizan ampliamente para estudiar el proceso infeccioso. Una extensión de esta técnica consiste en transfectar células 293TT con genomas de papilomavirus recombinados además del vec- tor de expresión de L1 y L2. Las partículas víricas resultantes contienen genomas del HPV y se denominan «cuasivirus». 206 Los cuasivirus pue- den utilizarse como sustituto de los viriones derivados de las lesiones en los estudios virológicos básicos; tienen la ventaja añadida de que pue- den contener genomas mutados y no podrían producirse de otro modo. Los genomas de los marcadores-PV están relacionados tanto con los seudovirus como con los cuasivirus. Se trata de genomas de PV recombinados en los que la región tardía ha sido sustituida por genes que codifican GFP, marcadores seleccionables por fármacos o ARN de horquilla corta ( short hairpin ). 57,274 Las fases tempranas y persistentes de la infección pueden estudiarse en células infectadas o transfectadas con estos genomas, pero no son capaces de completar el ciclo de vida vírico en ausencia de los genes tardíos.

A

INFECCIÓN POR PAPILOMAVIRUS EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Hasta ahora, la naturaleza específica de las especies de PV ha impe- dido la adaptación de la auténtica infección por HPV a los animales de experimentación. Sin embargo, los modelos animales de PV han desempeñado un papel importante en la comprensión de la patogé- nesis del papiloma. Los conejos silvestres de cola de algodón ( Sylvilagus floridanus ) son un hospedero natural del CRPV. 235 Los estudios experimentales con SfPV1/CRPV pueden llevarse a cabo en el hospedero natural, pero las dificultades para mantener a los conejos de cola de algo- dón en condiciones típicas de jaula han hecho que la mayoría de los estudios con SfPV1/CRPV se lleven a cabo en conejos domésti- cos ( Oryctolagus cuniculus ) estrechamente relacionados. 30 El SfPV1/ CRPV puede inducir fácilmente papilomas en conejos domésticos, donde su persistencia y progresión a cáncer cutáneo ocurre con más frecuencia que en los cola de algodón. Aunque los papilomas de los cola de algodón suelen contener grandes cantidades de SfPV1/ CRPV infeccioso, las lesiones de los conejos domésticos contienen poco o ningún virus infeccioso. También se pueden inducir papi- lomas mediante la aplicación de ADN genómico de SfPV1/CRPV «desnudo», lo que permite realizar análisis mutacionales del ciclo de vida vírico en este modelo. 144 Los genomas de SfPV1/CRPV también se han incorporado a las cápsides de L1/L2 de otros tipos de papilo- mavirus y los seudovirus resultantes se han utilizado para evaluar la capacidad protectora de las vacunas profilácticas contra el HPV. 173 FIGURA 2-15 Cultivos RAFT ® que muestran queratinocitos norma- les ( A ) y queratinocitos transfectados con el genoma completo del HPV16 ( B ). Los queratinocitos normales se estratifican y diferencian con un aumento de la relación citoplasma-núcleo en las células de la mitad superior del epitelio y una capa granular prominente. En los queratinocitos transfectados con el HPV16, si bien se produce la estra- tificación, la diferenciación es anómala. Hay hiperplasia de células en la capa parabasal y se observan figuras mitóticas en la mitad superior del epitelio. No se observa ninguna capa granular y la relación citoplas- ma-núcleo no cambia en todo el epitelio estratificado. Esta morfolo- gía es similar a la neoplasia cervicouterina intraepitelial (NIC, cervical intraepithelial neoplasia ). Cortesía de D. McCance. SAMPLE B