Pavon. Inmunología molecular, celular y traslacional, 2ed

Inmunología molecular, celular y traslacional 423

Recuadro 28-3. Pruebas moleculares para el diagnóstico de COVID-19 ( continuación )

Muestra

SARS-CoV2-19

Proteína S ( spike ) subunidades S1 y S2 Proteínas antigénicas

Genes

ARN polimerasa dependiente de ARN replicasa necesaria para la replicación del virus Glucoproteína de la envoltura proteína de membrana altamente hidrofóbica

ORF1ab

Proteína N ( Nucleoprotein )

E

Genes no estructurales

Genes estructurales

ORF1a

ORF1b

PLpro

S

N ME

3CLpro RdRp Hel

RT-PCR

Positivo

Negativo

5

2

3

1

4

Pruebas rápidas (ensayo inmunofluorescente)

3

4

5

2

N N N

N

N N

Pruebas rápidas (inmunocromatografía)

IgM

N N

1

2

Control IgG IgM

Negativo

IgM positivo

IgG positivo

IgM/IgG positivo

3

IgG

IgM IgG C

ELISA

1

3a

3b

4

5

2

Figura 28-3-1. Pruebas moleculares para la detección de SARS-CoV-2. 1) exudado nasofaríngeo u orofaríngeo), 2) inactivación del virus y extracción del ARN viral, 3) Síntesis de ADN de cadena simple (ADNc) 4) en un termociclador la ADN polimerasa realiza copias del ADNc, lo que genera señal fluorescente que es detectada en tiempo real, 5) el equipo muestra una curva de fluorescencia interpretada como positiva o negativa. Ensayo inmunofluorescente: 1) Exudado nasogaríngeo u orofaríngeo, 2) destrucción del virus y exposición de sus proteínas internas, 3) este medio es colocado en el dispositivo de prueba, 4) el líquido corre a través del dispositivo y los antígenos del virus se unen a anticuerpos fijados, anticuerpos secundarios unidos a reporteros emiten una señal fluorescente 5) Equipo de lectura detecta la señal de presencia o ausencia de virus. Inmunocromatografía: 1) muestra sanguínea, 2) la muestra sanguínea se pone en el dispositivo de prueba, un antígeno viral recombinante unido a oro coloidal se unirá a los anticuerpos propios, 3) visualmente se observan las bandas de detección que permiten su interpretación. ELISA: 1) muestra sanguínea, 2) separación de suero que contiene los anticuerpos propios o el virus, 3a) unión de anticuerpos monoclonales a antígenos del virus, 3b) unión de antígeno viral recombinante a anticuerpos propios, 4) adición de anticuerpos monoclonales marcados permite cambio de color, 5) un lector de placas detecta la absorbancia y se obtiene un resultado de la presencia del virus o anticuerpos contra el virus. Pruebas moleculares en investigación: CRISPR El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic re- peats ), consta de dos elementos principales: uno funcional (una nucleasa que corta ADN) y otro que brinda especificidad (un ARN que funciona como guía para posicionar a la enzima). Diversas aproximaciones de este sistema se han desarrollado para identificar al SARS-CoV-2. Entre ellas se encuentra SHERLOCK, DETECTR y AOID. 1. SHERLOCK. Se desarrolló en el laboratorio de Feng Zhang del Instituto Broad y utiliza como elemento funcional a la enzima Cas13a que, después de su unión al ARN guía, se activa y degrada el ARN presente en la reacción. Para la detección se añaden al ARN diana fragmentos de ARN complementarios marcados con fluoresceína que emiten una señal detectable al ser degradados por la enzima. La activación de la enzima implica la detección de la secuencia específica del ARN viral en la muestra. La adaptación de SHERLOCK para detectar SARS-CoV-2 se basa en la detección de la secuencia del ARN viral que codifica para la proteína S (participa en el ingreso del virus a las células), y en la secuencia del gen ORF1ab (codifica para una replicasa). Esta prueba fue aprobada por la FDA para su uso de emergencia en el diagnóstico de SARS-CoV-2 en laboratorios certificados. 2. DETECTR. Este sistema se desarrolló en la University of California en Berkeley y emplea Cas12a como enzima funcional para detectar ADN. Para detectar SARS-CoV-2 se hizo una adaptación para que el ARN viral sea copiado a ADN y después amplificado por el método de amplifi- cación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Esta prueba detecta la información genética de los genes N y E, que codifican respectivamente para proteínas de la nucleocápside y de la envoltura de SARS-CoV-2. Si bien la prueba ha sido validada en muestras de pacientes con COVID-19, aún no se aprueba para fines diagnósticos. ( continúa ) SAMPLE

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