Norris_Porth. fundamentos. 5ed

4 C ontrol g ené tico d e la f unción celular y la h erencia 6 3

C A P Í T U L O

H uella del A D N La técnica de huella del ADN también utiliza tecnología de ADN recombinante, así como principios básicos de genética médica. 11 Con el uso de enzimas de restricción, el ADN se escinde primero en regiones especí‚cas (‚g. 4-13). Los frag- mentos se separan según el tamaño por electroforesis y se des- naturalizan (calentando o tratando químicamente) de manera que todo el ADN sea de una sola hebra. El ADN monocatena- rio se trans‚ere luego a papel de nitrocelulosa, se hornea para ‚jar el ADN al papel y se trata con una serie de sondas radiac- tivas. Una vez que se ha permitido que las sondas radiactivas se unan con el ADN desnaturalizado, se utiliza una radiogra- fía para revelar los fragmentos de ADN marcados. Cuando se usa en la patología forense, este procedimiento se aplica a muestras del sospechoso y la muestra forense. Esto se puede hacer incluso con muestras muy pequeñas de ADN (un solo cabello o una gota de sangre o saliva) usando ampli‚cación mediante reacción en cadena de la polimerasa . Los patrones de bandas de ADN entre muestras se analizan para ver si coinciden. Con los métodos convencionales de análisis de la sangre y las enzimas séricas, existe una proba- bilidad de 1 en 100 a 1000 de que las dos muestras coinci- dan por obra de la casualidad. Con la huella del ADN, estas probabilidades son de 1 en 100000 a 1 millón. T erap ia gé nica Aunque es bastante diferente insertar material genético en un microorganismo unicelular, como las bacterias, existen técnicas para la inserción de genes en el genoma intacto de plantas y animales multicelulares. Los vehículos de entrega más prometedores para estos genes son los adenovirus. Re- presentan vehículos ideales porque su ADN no se integra dentro del genoma del hospedero. Sin embargo, a menudo se necesitan inoculaciones repetidas porque el sistema inmuni- tario del cuerpo generalmente ataca a las células que expre- san proteínas de adenovirus. Este tipo de terapia es todavía uno de los métodos más prometedores para el tratamiento de alteraciones genéticas como la ‚brosis quística, ciertos ti- pos de cáncer y numerosas enfermedades infecciosas. Se utilizan dos abordajes principales en la terapia génica: los genes transferidos pueden reemplazar genes defectuosos, o pueden inhibir selectivamente la expresión de genes nocivos. Las secuencias de ADN clonadas suelen ser los compuestos utilizados en la terapia génica. Sin embargo, la introducción del gen clonado en el organismo multicelular puede in³uir solo en las pocas células que obtienen el gen. Una respuesta a este problema sería la inserción del gen en un espermato- zoide u óvulo; después de la fertilización, el gen se replicaría en todos los tipos de células diferenciadoras. Aun así, las técnicas para la inserción celular son limitadas. No solo se trata de cuestiones morales y éticas, sino que estas técnicas no pueden hacer que el ADN insertado se adhiera a un cro- mosoma en particular o que suplante un gen existente al eli- minarlo de su lugar. Te cn ol og í a d e i n te rf e re n ci a d e l ARN Un abordaje de la terapia génica se centra en el reemplazo descrito previamente de genes faltantes. Sin embargo, varias

identi‚carse a menudo analizando la secuencia de aminoá- cidos y el codón de ARNm de su producto proteico. Las se- cuencias cortas de pares de bases pueden sintetizarse, marcar radiactivamente y, después, utilizarse para identi‚car su se- cuencia complementaria. De esta manera, es posible identi- ‚car estructuras genéticas tanto normales como anómalas. A islamiento y clonació nde g enes Los métodos de aislamiento y clonación de genes utilizados en la tecnología del ADN recombinante se sustentan en el hecho de que los genes de todos los organismos, desde las bacterias hasta los mamíferos, se basan en una organización molecular similar. La clonación del gen requiere cortar una molécula de ADN, modi‚car y reensamblar sus fragmentos, y producir copias del ADN modi‚cado, su ARNm y su pro- ducto genético. La molécula de ADN se corta mediante el uso de una enzima bacteriana, llamada enzima de restric- ción , que se une al ADN donde se encuentra una secuencia corta particular de pares de bases y escinde la molécula en un sitio de nucleótidos especí‚co. De esta manera, una mo- lécula de ADN larga se puede descomponer en fragmentos más pequeños y discretos, uno de los cuales contiene el gen de interés. Se dispone de forma comercial de numerosas en- zimas de restricción que cortan el ADN en diferentes sitios de reconocimiento. Los fragmentos de ADN a menudo se pueden replicar a través de la inserción en un organismo unicelular, como una bacteria. Para hacer esto, se usa un vector de clonación, como un virus bacteriano o un pequeño círculo de ADN que se encuentra en la mayoría de las bacterias, llamado plás- mido . Los vectores víricos y plásmidos se replican de forma autónoma en la célula bacteriana hospedera. Durante la clonación de genes, un vector bacteriano y el fragmento de ADN se mezclan y se unen a través de una enzima especial llamada ADN ligasa . Los vectores recombinantes formados se introducen después en un cultivo adecuado de bacterias y se permite que estas se repliquen y expresen el gen del vec- tor recombinante. A p licaciones f ar macé uticas Los métodos de tecnología de ADN recombinante también se pueden usar en el tratamiento de enfermedades. Por ejem- plo, la tecnología de ADN recombinante se utiliza en la fabri- cación de insulina humana empleada para tratar la diabetes mellitus. El ADN recombinante correspondiente a la cadena A de la insulina humana se aisló y se insertó en plásmidos que, a su vez, se utilizaron para transformar Escherichia coli . Las bacterias después sintetizaron la cadena de insulina. Se usó un método similar para obtener las cadenas B. Posteriormente, las cadenas A y B se mezclaron y se dejaron plegar y formar enlaces disulfuro, produciendo moléculas de insulina activa. También se ha producido la hormona del crecimiento hu- mano en E. coli . Las proteínas más complejas se forman en cultivos de células de mamíferos empleando técnicas de ADN recombinante. Estas proteínas incluyen la eritropoyetina, que se usa para estimular la producción de eritrocitos; el factor VIII, que sirve para tratar la hemo‚lia; y el activador tisu- lar del plasminógeno, que se administra con frecuencia des- pués de un ataque cardíaco para disolver los trombos.