Braverman.Tiroides_11ed

La tiroides normal

CAPÍTULO 4 n Síntesis de hormona tiroidea 67

de yodo a los residuos de tirosina en la tiroglobulina (organifi- cación) y acoplamiento de yodotirosinas para generar T4 y T3 (fig. 4-1). La purificación y propiedades bioquímicas de la TPO fueron analizadas de manera exhaustiva en versiones anteriores de este capítulo por A. Taurog (162,163), y la función de la TPO como autoantígeno en la enfermedad tiroidea autoinmune se ana- liza en el capítulo 37.

difieren en la orientación y exposición de los sitios activos en rela- ción con la membrana. La estructura cristalina de lactoperoxi- dasa (LPO) complejada con metimazol (MMZ) se ha resuelto con una resolución de 1.97 Å. El MMZ parece estar sujeto de manera firme entre el motivo hemo de un lado y las partes hidrófobas de la proteína (185). El plegado y la inserción de la membrana adecuados son esencia- les para la actividad enzimática. Los estudios inmunohistoquímicos ubican a la TPO en la membrana apical (186) y también se encuen- tra abundante inmunopositividad en el citoplasma (187). La estimu- lación aguda con TSH aumenta la inmunorreactividad de la TPO en la membrana apical y aumenta la actividad enzimática (188,189). Por lo tanto, es probable que la TPO llegue a la membrana apical a través de la vía secretora. La organización y movilización de TPO dependen del tipo de célula (190). En sistemas de células heterólogas transfectadas de forma estable, la TPO a menudo se retiene en gran medida en los compartimentos intracelulares (190-193). Por el con- trario, llega a la membrana plasmática de forma eficaz en células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de forma transitoria y en células tiroideas PCCl3 de rata transfectadas de forma estable (190). Estos hallazgos sugieren que la inserción continua de TPO en la membrana requiere la presencia de factores tiroideos específicos o restringidos por tiroides. Antes de la clonación del ADNc de TPO, se purificó TPO catalí- ticamente activa solubilizando fracciones de membrana de tejido tiroideo con detergente y digestión proteolítica limitada (174). Después de la clonación molecular del ADNc de TPO, la TPO recombinante se ha expresado en células de mamíferos, células de insectos y levaduras (para una revisión, véase [169]). Las prepa- raciones de TPO recombinante han sido en particular útiles para estudios inmunológicos, aunque muchas tienen menor actividad catalítica (163,194). Las células eucariotas pueden ser más ade- cuadas como sistema de expresión para obtener una TPO recom- binante funcional y soluble, se presume que debido a su capacidad para glucosilar por completo la proteína (194). La actividad de la TPO incrementa in vivo con la TSH (195, 196), y este efecto estimulante es consecuencia de una mayor síntesis de TPO (197). La estimulación con TSH también aumenta la movi- lización de la TPO a la membrana apical (191). Los mecanismos que conducen a la estimulación de la síntesis de TPO varían en diferentes sistemas modelo. La TSH y los estimuladores farmacoló- gicos de la vía de señalización de AMP cíclico aumentan los niveles de ARNm de TPO en cultivos de células tiroideas (198–202). En las células FRTL-5, el aumento en los niveles de ARNm de TPO se debe a un incremento en la estabilidad del ARNm (200,201), mientras que la estimulación transcripcional explica el aumento en las células tiroideas caninas (199,203). A diferencia de la TSH, la tiroglobulina folicular disminuye la expresión de TTF-1, TTF-2 y PAX-8, acciones que disminuyen la expresión de los genes recepto- res de TPO, NIS, TG y TSH (39,40). La TSH y la forskolina aumentan rápidamente la actividad del promotor de TPO sin la necesidad de síntesis de proteínas (204). Esta estimulación correlaciona con un aumento en la unión de CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PEROXIDASA TIROIDEA

LA ESTRUCTURA GENÉTICA Y PROTEICA DE LA PEROXIDASA TIROIDEA

El gen de la TPO humana se encuentra en el cromosoma 2pter-p12 (164,165), comprende aproximadamente 150 kb y consta de 17 exones separados por 16 intrones (166). Los primeros ADNc que codifican TPO se aislaron de bibliotecas de ADNc humano y porcino (164,167-169). El ADNc de la TPO humana de longitud completa codifica una proteína de 933 aminoácidos (164). Ade- más del ARNm de longitud completa que codifica la TPO de lon- gitud completa (TPO1), se han identificado varias transcripciones más cortas de importancia biológica desconocida (164,170,171). La transcripción alternativa más abundante carece de 171 nucleó- tidos, debido a la deleción del exón 10, que comprende los codo- nes 533–590 (TPO2) (164,172). La proteína codificada carece de actividad enzimática (172). En los análisis de inmunotransferen- cia, la TPO aparece como un doblete de 110 y 105 kDa, un fenó- meno que no se explica por la traducción de TPO2 (173). El extremo amino terminal de la TPO se localiza en la luz de los folículos tiroideos, y el dominio extracelular forma un bucle creado por dos enlaces disulfuro intramoleculares (humano) o uno (porcino), seguido por un dominio que atraviesa la membrana en estrecha proximidad a su extremo carboxi-terminal (174,175). La introducción de un codón de detención inmediatamente corriente arriba del dominio transmembrana putativo (en los aminoácidos 846 a 870) da como resultado una proteína soluble que se secreta en el medio y conserva la actividad enzimática (176). La TPO humana tiene cinco sitios potenciales de glucosilación, y aproxi- madamente 10% de su peso son carbohidratos (163). La ubica- ción y la naturaleza de las unidades de oligosacáridos unidos a N se han determinado solo para la TPO porcina (177). El grupo hemo protésico, un hemo bis -hidroxilado distinto del hemo b (protoporfirina IX) que se encuentra en muchas otras hemoproteínas, está unido covalentemente a la glutamina 399 y al aspartato 238 de la apoproteína (178). Las cadenas laterales de aminoácidos coordinadas de forma directa con el átomo de hierro o ubicadas en su proximidad inmediata son críticas para modular la reactividad y especificidad de la enzima (para una discusión más detallada, véase [179]). Todas las peroxidasas de mamíferos pertenecen a la misma familia de genes (180). La TPO tiene un alto grado de similitud de secuencia con la mieloperoxidasa (MPO). Los primeros 735 aminoácidos de TPO tienen una identidad de secuencia de 42% con MPO (168), y la homología entre TPO y MPO en la vecindad del grupo hemo es tan alta como 74% (167). Según los análisis de secuencia, que han revelado dominios homólogos al factor de cre- cimiento epidérmico, complemento C4b y la citocromo C oxidasa I mitocondrial, el gen TPO puede ser un gen mosaico (168). La estructura de MPO se ha resuelto primero a una resolución de 3 Å (181) y luego a una resolución de 1.8 Å (182,183). El modelado molecular de la estructura de la TPO y la organización del dímero sugieren un motivo de dimerización de espiral-espiral carboxi-ter- minal, que ancla al dímero en la membrana apical (184); se han generado dos modelos contrastantes pero plausibles de TPO que

EXPRESIÓN Y REGULACIÓN DE PEROXIDASA TIROIDEA SAMPLE