9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

la deISGilación por el PLpro sobreexpresado del SARS-CoV inhibie ron la señalización inmunitaria innata. 302 El dominio PLpro contiene dos bolsillos de unión para la ubicuitina y el estructuralmente rela cionado con el ISG15 que están separados de los cuatro bolsillos de unión al sustrato para sus sustratos coronavíricos. 302,303 Devaraj y cols. han informado que la interferencia con el IRF3 por el PLpro sobreex presado del SARS-CoV no requiere que sea enzimáticamente activo. 78 Por el contrario, Deng y cols. 75 crearon cepas recombinantes del MHV con mutaciones, las cuales disminuían la unión de la ubicuitina y el ISG15 al dominio PLpro2 del MHV, lo que redujo en gran medida las actividades de desubicuitinación y deISGilación, pero permitió el procesamiento de la poliproteína del MHV por el PLpro2 y, por lo tanto, la recuperación del virus infeccioso. Estos virus activaron una respuesta del IFN más rápidamente que el virus parental de tipo sil vestre en los macrófagos y redujeron considerablemente la cantidad de virus en el hígado de los ratones infectados. El PLpro del SARS-CoV ha sido una diana para el desarrollo de fármacos antivirales que blo queen su actividad proteolítica, y se han desarrollado varios compues tos con concentraciones que producen una inhibición del 50% en el rango micromolar bajo con buena selectividad en análisis bioquímicos ( véanse las refs. 15 y 205). Los dos dominios siguientes, el dominio de unión a ácidos nucleicos (NAB, nucleic acid binding ) y el dominio específico de beta coronavirus, no se han estudiado en profundidad. El dominio NAB se une al ARN monocatenario y su estructura se ha determinado por medio de RM. 268,323 Se sabe aún menos sobre el dominio específico de betacoronavirus. La nsp3 contiene dos TMD 277 separados por un dominio 3Ecto, que está situado en el lado luminal de la membrana del RE. 277 Cuando la nsp3 se coexpresa con la nsp4, induce la curva tura de las membranas derivadas del RE, 130 y cuando se coexpresa con la nsp4 y la nsp6, induce la formación de DMV similares al orgánulo de replicación de los coronavirus. 13,101 El dominio 3Ecto de la nsp3 interactúa con los bucles luminales de la nsp4 impulsando la curvatura de la membrana necesaria para la formación de DMV. 129,130 El segundo TMD de la nsp3 va seguido de un dominio helicoidal anfipático (AH1) hidrófobo que se localiza en el lado citosólico de la membrana del RE. La región carboxiterminal contiene dos dominios llamados Y1 e Y-CoV . Se desconoce su función. La nsp3 del SARS-CoV-2 se ha estudiado en gran medida en el contexto de los inhibidores de sus dos actividades enzimáticas, la actividad de deMARilación del macrodominio y la actividad de pro teinasa del dominio PLpro. La estructura del PLpro del SARS-CoV-2 se ha determinado mediante radiocristalografía y es bastante simi lar a la estructura previamente determinada del dominio PLpro del SARS-CoV. 101 Ambas enzimas escinden un sustrato peptídico modelo que imita el sitio de escisión entre la nsp2 y la nsp3 con eficiencias similares. 101 Sin embargo, las dos enzimas difieren en sus preferencias por sustratos ubicuitinados e ISGilados, con la enzima del SARS-CoV prefiriendo sustratos ubicuitinados y la enzima del SARS-CoV-2 prefi riendo sustratos ISGilados. 101,334 La base de esta diferencia se ha deter minado por medio de cocristalización de estas enzimas con ubicuitina o ISG15 y resolviendo las estructuras del PLpro en conjunto con estas moléculas. 334 Además, se ha informado que el PLpro purificado del SARS-CoV-2 escinde el IRF3 en un motivo LGGG in vitro , 256 lo que se correlaciona con la observación de que se encuentran concentra ciones reducidas de IRF3 en células infectadas por el SARS-CoV-2 en cultivo tisular. Varios inhibidores de la proteasa del SARS-CoV, incluido el inhibidor no covalente GRL-0617, 15,304 también son efica ces contra el SARS-CoV-2 183,334 inhibiendo tanto la replicación vírica como las actividades de desubicuitinación y deISGilasa del PLpro. Además, el tratamiento con GRL0167 de células infectadas por el SARS-CoV-2 aumentó la concentración de IRF3 ISG15ilado e incre mentó los valores de proteínas estimuladas por IFN por encima de los

detectados en células infectadas pero no tratadas, lo que sugiere que el inhibidor fue eficaz para revertir la inhibición de la respuesta antivírica al IFN por el SARS-CoV-2. 334 El segundo dominio enzimáticamente activo de la nsp3 del SARS-CoV-2, la ADP-ribosilhidrolasa Mac1, también se ha estudiado como posible diana farmacológica. Se ha sugerido que la desMARila ción del STAT1 puede contribuir a la hipercitocinemia asociada con COVID-19 58 grave, lo que convierte el dominio Mac1 en una posible diana terapéutica. Su estructura tridimensional ha sido determinada por cuatro grupos diferentes 7,31,248,300 y se ha caracterizado su interac ción con diversos sustratos. Como ya se ha mencionado, el macro dominio del SARS-CoV-2 tiene actividad deMARilante pero no dePARilante, siendo la enzima del SARS-CoV-2 algo más activa que el dominio Mac1 del SARS-CoV. Se identificaron bolsillos de unión potenciales tanto para el adenosilo como para la ribosa de los sustra tos 7,31,248,300 y se identificaron inhibidores potenciales mediante el aná lisis virtual y la optimización de inhibidores de una poli(ADP-ribosa) glucohidrolasa humana estructuralmente relacionada. 31 La detec ción sistemática contra varios nucleótidos y análogos de nucleótidos mostró una considerable flexibilidad del bolsillo de unión del ade nosilo y una sorprendente interacción con metabolitos activos del remdesivir, lo que sugiere otro posible abordaje para el desarrollo de inhibidores. 269 Nsp4 y nsp6 Las nsp4 y nsp6 tienen una longitud de 500 y 290 aminoácidos, res pectivamente. En su extremo N, el PLpro escinde la nsp4 de la nsp3, en tanto que en su extremo C, la proteasa principal (Mpro, main pro tease ), la proteasa contenida en la nsp5, escinde la nsp4 de la nsp5. La Mpro libera la nsp6 de la poliproteína pp1a coronavírica. La nsp4 con tiene cuatro TMD con los NTD y CTD expuestos hacia el citoplasma, un CTD de 100 aminoácidos y un bucle luminal relativamente grande entre el primer y el segundo TMD. 276 El bucle luminal de la nsp3 y el primer bucle luminal grande de la nsp4 son necesarios para la forma ción de DMV. 130,347 La nsp3, la nsp4 y la nsp6 se localizan en el RE cuando se expresan por separado; la coexpresión de la nsp3, la nsp4 y la nsp6 da como resultado la relocalización de estas proteínas a focos per inucleares. 12,129,130,276 Los estudios de tomografía electrónica de células que coexpresan la nsp3 y la nsp4 en ausencia de la nsp6 mostraron que estas dos proteínas son suficientes para formar estructuras, las cuales se asemejan al orgánulo de replicación de DMV que se encuentra en las células infectadas. 279 Esto está respaldado por la colocalización anterior de estas proteínas en focos perinucleares que contienen la nsp8, 297 un componente de la maquinaria de replicación del ARN ( véase más ade lante) en células infectadas. El número de estudios sobre las nsp4 y nsp6 del SARS-CoV-2 es limitado. Un análisis de detección de sobreexpresión de proteínas que antagonizan la respuesta al IFN ha mostrado que la nsp6 suprime la secreción de IFN de tipo I en respuesta a poli(I:C). 405 Un análisis más detallado del efecto de la sobreexpresión de la nsp6 en la inducción del IFN y las respuestas al IFN mostró que esto inhibe la fosforila ción de la cinasa 1 de unión al NF- κ B asociada con los miembros de la familia Traf y su diana secuencia abajo, el IRF3, dos acontecimien tos necesarios para la inducción del IFN- β ; además, regula a la baja la señalización del receptor de IFN mediante la inhibición de la fos forilación del STAT1 y el STAT2. Por el momento, se desconoce el mecanismo por el que la nsp6 produce estos efectos; tampoco se han verificado estos efectos de la nsp6 en la respuesta al IFN en células infectadas. Un análisis de socios de unión del hospedero con proteínas del SARS-CoV-2 sobreexpresadas individualmente identificó la pro teína receptora σ -1 del RE como socio de interacción con la nsp6, y varias proteínas mitocondriales que forman parte del complejo TIM

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