9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

interacciones no bloquean la unión del mRNA al ribosoma, sino que impiden la conformación fisiológica del complejo de preinicio 48S al restringir la rotación de la cabeza ribosómica 40S y la carga del mRNA en el canal de ingreso. 423 El SL1, el primer SL de la UTR 5 ′ , cuando está presente en el extremo 5 ′ de un mRNA, interactúa con el NTD globular de la nsp1, permitiendo el ingreso del mRNA en el canal de ingreso y la posterior traducción. 17,194,333,364 La estructura del NTD (aminoácidos 10-127) se ha determinado mediante radiocristalogra fía 57,321 y es similar en general a la estructura del NTD de la nsp1 del SARS-CoV, con algunas alteraciones en los bucles expuestos a la superficie. Una actividad de la nsp1 de la que no se había informado anteriormente es su inhibición de la exportación de mRNA del núcleo. Zhang y cols. 433 han mostrado que la nsp1 interactúa con la maquina ria de exportación nuclear de mRNA uniéndose al receptor de expor tación nuclear NFX1, así como que la infección por el SARS-CoV-2 inhibe la translocación de ARN poliadenilados del núcleo al cito plasma, un efecto similar al observado con la reducción de NFX. Este efecto podría replicarse mediante la sobreexpresión de la nsp1 y la inhi bición de la exportación nuclear de mRNA podría superarse mediante la sobreexpresión del NFX1 en células infectadas por el SARS-CoV-2. Además, se mostró que la sobreexpresión de la nsp1 desplazaba al NFX1 de sus socios de unión en el complejo del poro nuclear, lo que proporciona una base funcional para estas observaciones. Nsp2 Se ha llevado a cabo un número relativamente limitado de estudios sobre la nsp2 coronavírica, incluidas las nsp2 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2, lo que la convierte en una de las proteínas de coronavirus menos conocidas. La proteína nsp2 de 638 aminoácidos es escindida proteolíticamente de la poliproteína precursora ORF1a por el domi nio PLpro en la nsp3. 297 Las nsp2 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 no están tan bien conservadas como muchas de las otras nsp, con solo un 68.3% de identidad de secuencia. La proteína no es esencial para el SARS-CoV, y presumiblemente para el SARS-CoV-2, o para la replica ción del MHV en cultivos celulares, ya que se han recuperado mutan tes viables del SARS-CoV y el MHV en los que se ha eliminado toda la secuencia codificante de la nsp2 mediante genética inversa. 117 Estos mutantes mostraron una atenuación de la replicación vírica en cultivos celulares permisivos alcanzando valores de 1-1.5 log más bajos que el correspondiente virus isógeno de tipo silvestre. Se han llevado a cabo pocos estudios funcionales de esta proteína, pero Prentice y cols. 297 mostraron que la nsp2 del SARS-CoV se colocaliza, con la nsp3 y la nsp8, en vesículas de doble membrana (DMV, double membrane vesic ular ) asociadas con la síntesis de ARN vírico. Utilizando el sistema del MHV, Hagemeijer y cols. 128 mostraron que la nsp2 marcada fluores centemente y expresada por medio de transfección transitoria se loca lizaba difusamente en el citoplasma en células no infectadas, pero era reclutada a las DMV, el sitio de síntesis del ARN de los coronavirus, en células infectadas por el MHV. La asociación de la nsp2 con las DMV se confirmó mediante inmunocrio-ME. Los experimentos de expresión de truncamientos superpuestos de la nsp2 fusionados con un marcador fluorescente revelaron que el fragmento carboxiterminal que abarca los aminoácidos 247-585 era suficiente para esta localiza ción en las DMV. Los experimentos de fotoblanqueo mostraron que, una vez reclutada en las DMV, la nsp2 no se intercambiaba libremente tras el fotoblanqueo. Un estudio de doble híbrido en levadura seguido de análisis de coprecipitación confirmatorios de proteínas sobreexpre sadas en células de mamífero para identificar socios de unión entre las proteínas del SARS-CoV identificó la nsp4 y la nsp6, dos proteínas asociadas con las DMV; la nsp8, la nsp11 y la nsp16, asociadas con la síntesis y la formación del capuchón del ARN vírico; y la ORF3a del SARS-CoV, una proteína accesoria asociada con el virión, 154,330 como socios de unión para la nsp2. 380 En un estudio para identificar posibles socios de unión al hospedero de la nsp2 del SARS-CoV mediante una estrategia de

espectroscopia de masas con precipitación de sobreexpresión se iden tificaron 11 proteínas, y la unión de dos de estas proteínas, PHB1 y PHB2, se verificó mediante inmunoelectrotransferencia (análisis West ern blot ). 61 Estas dos proteínas se han asociado con diversos procesos celulares: progresión del ciclo celular, biogénesis mitocondrial, dife renciación celular y apoptosis. 61 Un estudio comparativo que utilizó una estrategia similar de purificación por afinidad y espectroscopia de masas para sondear las interacciones de las proteínas del hospe dero con la nsp2 identificó cuatro proteínas, ERLIN1, ERLIN2, RNF170 y TMEM, que interactuaban tanto con las proteínas nsp2 del SARS-CoV como con las del SARS-CoV-2, y 16 proteínas que se unían de forma única a cada una de ellas. 66 Este estudio también confirmó la unión de la nsp2 del SARS-CoV a la PHB2. La colocali zación por inmunofluorescencia indicó que una cantidad considerable de la nsp2 se localizaba en las membranas del RE en células no infec tadas. 66 La red de unión de proteínas y los análisis de enriquecimiento de genes sugieren que la nsp2 desempeña un papel en la interacción con la interfase del RE mitocondrial. 66 Hasta el momento, no se han realizado estudios para confirmar estas interacciones con proteínas del hospedero en células infectadas ni para evaluar la importancia funcio nal de cualquiera de las interacciones nsp2-proteína del hospedero en células infectadas por virus. Dos estudios de variación genética en aislados del SARS-CoV-2 han identificado un patrón interesante de variación de secuencia que implica a la nsp2. 296,426 Zeng y cols. 426 identificaron dos vínculos epistáticos de una mutación T85I de la nsp2, tanto con una muta ción Q57H en la proteína ORF3a como con un cambio de secuencia no codificante en la nsp14. Pohl y cols. 296 analizaron 14 aislados de pocos pases para detectar diferencias en su capacidad de replicación en células Vero o células epiteliales bronquiales. Los tres aislados que se replicaron bien en las células epiteliales bronquiales, pero relativa mente mal en las células Vero, contenían todos las mutaciones T85I vinculadas a la nsp2 y Q57H vinculadas a la ORF3a. La frecuencia de estos cambios reflejó la regularidad con la que se encuentra este enlace en el SARS-CoV-2 y no se seleccionaron más en cultivo mediante pases de los 14 virus estudiados. Se desconoce el o los mecanismos subyacentes a esta relación. Nsp3 La nsp3 es la mayor y estructuralmente más compleja de las nsp codi ficadas por el ORF1a (fig. 21-8). Es escindida proteolíticamente a partir del producto primario de traducción de la OF1a, por el domi nio PLpro contenido en la propia nsp3. 443 Se trata de una proteína multidominio de 1945 aminoácidos en el SARS-CoV-2 y 1922 ami noácidos en el SARS-CoV que contiene 15 dominios reconocidos. 206 La diferencia de tamaño entre las proteínas nsp3 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 se debe en gran parte a una deleción de 19 aminoáci dos en el dominio hipervariable de la región aminoterminal más dos deleciones más pequeñas, de dos y tres aminoácidos, en esta misma región. Se desconoce la importancia funcional de estas deleciones. La organización de los dominios y las funciones de nsp3 del SARS-CoV se resumen en la figura 21-8. A continuación, se analizan los distintos dominios desde el extremo N hasta el extremo C de la nsp3. Se han realizado caracterizaciones estructurales y funcionales de muchos de estos dominios para el SARS-CoV y para el betacoronavi rus más distante, el MHV, las cuales se resumirán brevemente. El dominio más aminoterminal de la nsp3 contiene un pliegue similar a la ubicuitina y se designa como dominio 1 similar a la ubicuitina (Ubl1, ubiquitin-like domain 1 ) por ser el primero de los dos dominios similares a la ubicuitina en las proteínas nsp3 coronavíricas. La estructura del dominio Ubl1 del SARS-CoV se ha determinado mediante espec troscopia por RM. 322 Se han asignado dos funciones a este dominio: una actividad de unión al ARN monocatenario 323 y, para el dominio Ubl1 de la nsp3 del MHV, una actividad de unión a la proteína N, que desem peña un papel importante en las fases iniciales de la replicación vírica y

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