9788419284617_Howley.Virus de ARN

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Virología. Volumen 3. Virus de ARN

ARN vírico y el CTD se asocia para formar dímeros que se cree que facilitan el ensamblaje de la vRNP. 145,282,352,420 El NTD y el CTD orde nados están flanqueados por regiones intrínsecamente desordenadas (IDR, intrinsically disordered regions ) y separados por una IDR central conservada que contiene una región rica en serina y arginina (SR) que se fosforila en las células infectadas. Una estructura de alta resolución del dominio de dimerización de la proteína N del SARS-CoV-2 mues tra una estructura compacta similar a la de otros betacoronavirus, mien tras que la ampliación para incluir el CTD da lugar a la formación de homotetrámeros. 420 Las estructuras cristalinas de la N del SARS-CoV mostraban previamente un ensamblaje helicoidal de los dominios de dimerización que se propuso para formar la base de los filamentos heli coidales de la nucleocápside en los viriones. 49 Los modos de empaque tamiento dímero-dímero de la N del SARS-CoV-2, revelados en las estructuras cristalinas, muestran que la proteína N no se ensamblaría en filamentos helicoidales. Esto sugiere que los dímeros del CTD pueden no constituir la base para la interacción con el ARN vírico y el ensam blaje de los filamentos helicoidales de la proteína N o las vRNP esféri cas que recientemente también se describieron mediante crio-TE. 182,420 Ensamblaje y liberación del SARS-CoV-2 Los coronavirus se ensamblan en el ERGIC, donde los viriones geman hacia la luz ( véase fig. 21-5). 184,349,366 Los estudios de crio-TE in situ han mostrado que los viriones del SARS-CoV-2 geman en áreas de alta densidad vesicular muy próximas a las membranas similares al RE y el Golgi. 182 Como ocurre con otros coronavirus, las proteínas estructurales del SARS-CoV-2 (S, M, N, E) interactúan para impul sar la gemación en las membranas del ERGIC. La proteína M desem peña un papel importante en el ensamblaje del virus a través de sus interacciones con las otras proteínas estructurales. 140 La coexpresión de las proteínas E y M es suficiente en muchos casos para la produc ción de VLP no infecciosas, las cuales forman la estructura básica de la envoltura vírica. 30,311 Las E y M del SARS-CoV-2 y del SARS-CoV son necesarias para la formación de VLP, pero la coexpresión con la proteína N mejora la producción de partículas. 26,30,295 Las proteínas E y M del SARS-CoV-2 son necesarias para la retención y la maduración de las proteínas S en el sitio de ensamblaje, como se ha mostrado para otros coronavirus. 26,30,295 Los trímeros de S del SARS-CoV-2 ubicados en los miembros ERGIC no impulsan por sí solos la curvatura de la membrana, sino que parecen reorganizarse lateralmente en la envol tura durante el ensamblaje del virión. 182 Los complejos ribonucleopro teínicos víricos formados por el ARN genómico y la proteína N se acumulan en las membranas curvadas donde tiene lugar la gemación, posiblemente reclutados por la curvatura de las membranas para ayu dar a impulsar el proceso de gemación. 182 El SARS-CoV-2 infecta eficazmente las células diferenciadas de las VRH. 442 El valor máximo de liberación del SARS-CoV-2 desde la superficie apical de las células de las VRH se produce entre 48 y 72 h después de la infección, mientras que el HCoV-NL63 y el SARS-CoV presentan una cinética más lenta, con un valor máximo de producción de virus entre 72 y 96 h después. 340 Se sabe menos sobre cómo los coronavirus son liberados, o salen, de las células. Tras el ensamblaje de las partículas coronavíricas, estas pasan por el Golgi, donde se produce la glucosilación y otros procesos postraduccionales. 241,274 Los estudios previos han mostrado que las par tículas víricas se liberan a través de la vía exocítica secretora. 30,231,366 Ha aparecido nueva información sobre el SARS-CoV-2 que describe el uso de una vía lisosómica dependiente de Arl8b para la salida y la libera ción. 105 En este estudio, se observó que las partículas del SARS-CoV-2 y el MHV gemaban en las membranas del ERGIC, se transportaban al Golgi, como ya se había visto, pero divergían moviéndose hacia los lisosomas para su salida y liberación de las células. Además, se observó una desacidificación lisosómica que provocó la interrupción de las vías de presentación de antígenos. 105 Se ha implicado a la proteína ORF3a del SARS-CoV-2 en la promoción de la exocitosis lisosómica, pero no

se conoce el mecanismo. 53 Se necesitan más estudios para comprender completamente la salida y la liberación de los coronavirus de las célu las infectadas.

PROTEÍNAS NO ESTRUCTURALES DEL SARS-CoV-2 (TABLA 21-1) El SARS-CoV-2 y otros betacoronavirus codifican 16 nsp, nsp1-nsp16, dentro del ORF1a y el ORF1b ( véase fig. 21-1B). Estas proteínas se sin tetizan de forma similar a como ocurre en otros coronavirus: como dos largas poliproteínas superpuestas que son procesadas cotraduccio nalmente a nsp individuales por un dominio de proteasa similar a la papaína (PLpro, papain-like protease ) contenido en la nsp3 (nsp1, nsp2 y nsp3) o por el dominio de proteasa de tipo 3C contenido en la nsp5 (nsp4-nsp16). Nsp1 La nsp1 del SARS-CoV-2 es la primera proteína codificada en las poli proteínas ORF1a/ORF1ab. Es escindida proteolíticamente a partir de la poliproteína precursora de la ORF1a por el dominio PLpro en la nsp3, al igual que la nsp1 de otros coronavirus. El resultado es una pro teína de 180 aminoácidos de longitud y una secuencia idéntica en un 84.4% a la nsp1 del SARS-CoV. Este alto grado de conservación de la secuencia entre las proteínas nsp1 del SARS-CoV y del SARS-CoV-2 ( véase tabla 21-1) se traduce en un alto grado de similitud funcional y estructural. Las proteínas nsp1 de ambos virus interfieren en la expre sión génica del hospedero (revisado en la ref. 263) y, en consecuencia, antagonizan el desarrollo de una respuesta del interferón (IFN) en las células infectadas. 158,168,206,263,265,395,405 La base molecular de la inhibición de la síntesis de proteínas del hospedero por la nsp1 se ha investigado ampliamente para el SARS-CoV. Los estudios en los que se utilizó la sobreexpresión ectó pica de la nsp1 y la nsp1 purificada del SARS-CoV expresada bac terialmente mostraron que la nsp1 promueve la degradación de los mRNA del hospedero, se une a la subunidad ribosómica 40S, inhibe la formación del ribosoma 80S e inhibe la traducción de los ARN con capuchón durante el proceso de inicio. 167,168,224 La unión de la nsp1 al complejo de preinicio del ribosoma 40S produce la escisión endo nucleolítica de los mRNA con capuchón en 5 ′ del hospedero cerca de su extremo 5 ′ durante el alargamiento de la traducción. 146,167,168,356 La nsp1 no contiene un motivo de nucleasa reconocido, y no se ha mostrado una actividad de ribonucleasa (RNasa) directa con la pro teína purificada, lo que sugiere que la nsp1 recluta una nucleasa hospe dera. 146,411 La nsp1 del SARS-CoV no induce la escisión de los mRNA del virus y confirió protección frente a la escisión endonucleolítica a los mRNA marcadores añadiendo la secuencia líder en 5 ′ del SARS-CoV a sus extremos 5 ′ . 146,356 Sin embargo, cuando se añadió la proteína nsp1 recombinante purificada a reacciones de traducción in vitro progra madas con un mRNA vírico o un mRNA hospedero que portaba la secuencia líder en 5 ′ y, por lo tanto, era resistente a la escisión mediada por la nsp1, la síntesis de proteínas seguía inhibida, lo que sugiere que la nsp1 inhibía directamente la síntesis de proteínas independiente mente de su escisión en los extremos 5 ′ de los mRNA hospederos. 147 No obstante, la cotransfección de un plásmido de expresión de la nsp1 y un constructo de luciferasa en la región no traducida (UTR, untrans lated regions ) 5 ′ del SARS-CoV no consiguió inhibir considerable mente la expresión de la luciferasa. 356 Otros estudios mostraron que el primer tallo-bucle (SL, stem-loop ) de la UTR 5 ′ se unía a la nsp1 y era suficiente para proteger los mRNA de la degradación nucleolí tica. 356 El análisis por RM de la proteína nsp1 del SARS-CoV indicó que los 12 aminoácidos aminoterminales no están estructurados y que los aminoácidos 13-128 forman un dominio globular bien plegado, seguido de un segundo CTD no estructurado. 8 El dominio globular

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